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丙酮酸脫羧酶(PDC)活性測定試劑盒說明書

閱讀:389      發(fā)布時(shí)間:2023-05-10
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丙酮酸脫羧酶(PDC)活性測定試劑盒說明書

                                               微量法100T/96S

 

 

   正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

PDC主要存在于酵母中,是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一,催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

 

測定原理:

PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛,添加乙醇脫氫酶(ADH)來進(jìn)一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+NADH340 nm有吸收峰,而NAD+沒有;通過測定340 nm光吸收下降速率,來計(jì)算PDC活性。

 

自備儀器和用品:

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4保存。

試劑二:液體18mL×1瓶,4保存。

試劑三:液體2.5mL×1瓶,4保存。

試劑四:粉劑×1支,﹣20保存。

試劑五:液體30μL×1瓶,﹣20保存。

混合試劑:臨用前配制,將試劑四和試劑五轉(zhuǎn)移至試劑三中充分溶解待用,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑六:液體2mL×1管,4保存。

 

粗酶液提取:

1、細(xì)菌或細(xì)胞處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每200萬細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率200W,工作3s,間歇10s,工作35次),16000g 4離心20min,取上清,置冰上待測。

2、組織處理:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿16000g 4離心20min,取上清,置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

PDC測定操作:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到340 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25水浴中預(yù)熱30min

3. 空白管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六,迅速混勻后于340nm比色,記錄15s75s的吸光值,分別記為A1A2

4. 測定管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六,迅速混勻后于340nm比色,記錄15s75s的吸光值,分別記為A3A4

 

注意:空白管只需測定一次。

 

PDC活性計(jì)算:

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1)按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷ε÷d×V×109}÷(Cpr×V) ÷T

=1608×[(A3A4)(A1-A2)]÷Cpr

2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:25中,每克組織每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位

PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷ε÷d×V×109}÷(W×V÷V樣總) ÷T

=1608×[(A3A4)(A1-A2)]÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:25中,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位

PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷ε÷d×V×109}÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總) ÷T

=1608×[(A3A4)(A1-A2)]÷細(xì)胞數(shù)量

4)按血清(漿)體積計(jì)算

活性單位定義:25中,每毫升血清(漿)每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位PDC (nmol/min /mL) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷ε÷d×V×109}÷V÷T

=1608×[(A3A4)(A1-A2)]

εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cmd:比色皿光徑,1cmV總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL=2×10-4 LV樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,0.02mLV樣總:提取液體積,1 mLCpr:蛋白濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒;W :樣品質(zhì)量; T:反應(yīng)時(shí)間,1 min

 

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

1)按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷ε÷d×V×109}÷(Cpr×V) ÷T

=3215×[(A3A4)(A1-A2)]÷Cpr

2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:25中,每克組織每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位

PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷ε÷d×V×109}÷(W×V÷V樣總) ÷T

=3215×[(A3A4)(A1-A2)]÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:25中,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位

PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷ε÷d×V×109}÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總) ÷T

=3215×[(A3A4)(A1-A2)]÷細(xì)胞數(shù)量

4)按血清(漿)體積計(jì)算

活性單位定義:25中,每毫升血清(漿)每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個(gè)酶活單位PDC (nmol/min /mL) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷ε÷d×V×109}÷V÷T

=3215×[(A3A4)(A1-A2)]

εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cmd96孔板光徑,0.5 cmV總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL=2×10-4

 

LV樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,0.02mLV樣總:提取液體積,1 mLCpr:蛋白濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒;W :樣品質(zhì)量; T:反應(yīng)時(shí)間,1 min

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