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脂肪酶（LPS）活性試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                  微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

LPS又稱(chēng)甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油（或者甘油二酯和單酯）。LPS廣泛的存在于各種生物中。血清中LPS的異常增高常見(jiàn)于胰腺炎和胰腺癌。

測(cè)定原理：

LPS催化油酯水解成脂肪酸，利用銅皂法測(cè)定脂肪酸生成速率，即可計(jì)算LPS活性。

自備儀器和用品：

研缽、臺(tái)式離心機(jī)、震蕩混勻器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、甲苯80mL、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體65mL×2瓶，4℃保存。

試劑二：液體10mL×1瓶，4℃保存。每次使用前用震蕩混勻器劇烈震蕩20min。

試劑三：甲苯80mL×1瓶，4℃保存（自備）。

試劑四：液體10mL×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體10 μL×1瓶，10 µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存。臨用前加入3.168 mL甲苯，充分溶解。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后12000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體: 直接檢測(cè)。

LPS測(cè)定操作：

1.        分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到710 nm，蒸餾水調(diào)零。

2.        試劑一和試劑二置于37℃水浴預(yù)熱30min。

3.        在1.5mL EP管中依次加入下列試劑

37℃振蕩反應(yīng)10 min

37℃振蕩反應(yīng)10 min后，8000g，25℃，離心10min，取上清液

37℃振蕩反應(yīng)5 min后，靜置5min，取200μL上層液加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm處測(cè)定吸光值。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

LPS活性計(jì)算公式：

1. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞LPS活性

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個(gè)酶活單位。

LPS (μmol/min/mg prot) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)- A空白管）]×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=16×[(A測(cè)定管－A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個(gè)酶活單位。

LPS (μmol/min/g 鮮重) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

=16×[(A測(cè)定管－A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]÷W

（3）按照細(xì)菌或者細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個(gè)酶活單位。

LPS (μmol /min/10⁴cell) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

=16×[(A測(cè)定管－A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]÷細(xì)胞數(shù)量

2. 血清等液體LPS活性

活性單位定義：37℃中每毫升血清每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個(gè)酶活單位。

LPS (μmol /min/mL) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]×V反總÷V樣÷T

=16×[(A測(cè)定管－A空白管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管）]

C標(biāo)準(zhǔn)品：10 µmol/mL；V反總：反應(yīng)總體積，0.8mL；V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W：樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間，10 min。

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