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吲哚乙酸氧化酶活性測定試劑盒說明書

閱讀:1112      發布時間:2023-05-07
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   :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

吲哚乙酸(IAA)在吲哚乙酸氧化酶的作用下,被氧化破壞失去活性。植物體內吲哚乙酸氧化酶活力的大小,對調節體內吲哚乙酸的水平,起著重要的作用,而影響植物的生長。

 

測定原理:
在無機酸存在情況下,吲哚乙酸能與FeCl3作用,生成紅色螯合物,該物質在530nm處有最大吸收峰,酶活力的大小可以其破壞吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法測定。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀、1.5mL離心管、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體120mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體10mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體10mL×1瓶,4℃保存。

試劑四:液體10mL×1瓶,4保存。

試劑五:液體2mL×1瓶,4避光保存。

試劑六:液體50mL×1瓶,4保存。臨用前吸取1mL試劑五加入試劑六中混勻,待用,避光保存

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質量(g:試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g4離心10min,取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g4,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體:直接測定。

 

測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到530 nm,蒸餾水調零。

2. 試劑二、試劑三、試劑四置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)水浴中保溫20min

3. 1.5mL EP管若干,按操作依次加入試劑,操作表如下:


標準管

測定管

試劑二(μL

20

20

試劑三(μL

20

20

試劑四(μL

40

40

樣本上清液(μL

0

20

試劑一(μL

120

100

充分混勻后置于30°恒溫水浴中,保溫反應30min

實際六(μL

400

400

充分混勻,置于30℃黑暗水浴保溫顯色30min。取200μL顯色后呈紅色的反應液于微量玻璃比色皿/96孔板中,用分光光度計或酶標儀中測定波長530nmOD值,標準管記為A1,測定管記為A2

注意:標準管只需做一次

 

IAA氧化酶活性計算公式:

a.        使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

IAA標準曲線公式:y = 1.334x + 0.025  R2 = 0.998 xIAA濃度,mmol /Ly為吸光值)

(1)         按蛋白濃度計算

酶活定義:從開始時加入的IAA量減去酶作用后殘留的IAA含量,即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h內分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 Uμmol/h/mg prot=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V÷V×Cpr÷T

=1.5×A1-A2÷Cpr

(2)         按樣本鮮重計算

酶活定義:以每g樣本在1h內分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

Uμmol/h/g 鮮重)=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V÷(V÷V樣總×W) ÷T

=1.5×A1-A2÷W

(3)         按細胞數量計算

酶活定義:以每1萬個細胞在1h內分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 

Uμmol/h/104 cell=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V÷(V÷V樣總×W) ÷T

=1.5×A1-A2÷細胞數量

(4)         按液體體積計算

酶活定義:以每mL酶液在1h內分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

Uμmol/h/mL=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V÷(V÷V樣總) ÷T

=1.5×A1-A2

V樣總:上清液總體積,1mLV樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02 mLCpr:上清液蛋白質濃度,mg/mLW:樣品質量,gT:反應時間,0.5h

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下

IAA標準曲線公式:y = 0.667x + 0.025  R2 = 0.998 xIAA濃度,mmol /Ly為吸光值)

1)按蛋白濃度計算

酶活定義:從開始時加入的IAA量減去酶作用后殘留的IAA含量,即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h內分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 Uμmol/h/mg prot=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V÷V×Cpr÷T

=3×A1-A2÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

酶活定義:以每g樣本在1h內分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

Uμmol/h/g 鮮重)=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V÷(V÷V樣總×W) ÷T

=3×A1-A2÷W

3)按細胞數量計算

酶活定義:以每1萬個細胞在1h內分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 

Uμmol/h/104 cell=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V÷(V÷V樣總×W) ÷T

=3×A1-A2÷細胞數量

4)按液體體積計算

酶活定義:以每mL酶液在1h內分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

Uμmol/h/mL=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V÷(V÷V樣總) ÷T

=3×A1-A2

V樣總:上清液總體積,1mLV樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02 mLCpr:上清液蛋白質濃度,mg/mLW:樣品質量,gT:反應時間,0.5h

 

注意事項:

Z低檢出限為0.01μmol/mL

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優利科(上海)生命科學有限公司

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