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胃蛋白酶(Pepsin)試劑盒說明書

閱讀:581      發布時間:2023-04-05
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胃蛋白酶Pepsin試劑盒說明書

                                              微量法100T/48S

   意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:                          

胃蛋白酶由胃粘膜主細胞分泌,分解食物中蛋白質成小肽段。一般用于神經性低酸癥的鑒別,慢性胃炎、慢性胃擴張、慢性十二指腸炎等癥狀時也會引起胃蛋白酶分泌的減少。

測定原理:

胃蛋白酶可催化血紅蛋白水解,水解產物與福林試劑反應后顯藍色;一定范圍內,其顏色的深淺與胃蛋白酶活性呈正比。

自備儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體20mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑二充分溶解。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入10mL蒸餾水充分溶解。

試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入15mL蒸餾水充分溶解。

試劑六:液體3.3mL×1瓶,4℃保存。

標準品:液體1.27mL×1支,0.5μmol/mL酪氨酸標準溶液濃度4℃保存。

粗酶液提取:

組織樣品:按照組織質量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g4離心10min,取上清,即粗酶液。

測定步驟:

1.分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到580 nm,蒸餾水調零。

2. 試劑三和試劑四置于37℃水浴預熱30min

3. 標準管:取微量玻璃比色皿/96孔板,加入20μL標準品,40μL試劑二,120μL試劑五,20μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于580 nm測光吸收,記為A標準管。

4. 空白管:取微量玻璃比色皿/96孔板,加入20μL蒸餾水,40μL試劑二,120μL試劑五,20μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于 580 nm測光吸收,記為A標準空白管。

5. 對照管: EP管,加入100 μL蒸餾水,置于37℃水浴保溫10min;加入100μL試劑四,蓋緊后搖勻1min;加入20μL粗酶液,混勻后8000g 4℃離心10分鐘取上清;在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL,再加入40μL試劑二,120μL試劑五,20μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于580 nm測光吸收,記為A空白管。

6. 測定管: EP管,加入20μL粗酶液,100μL試劑三,置于37℃水浴保溫10min;加入100μL試劑四,

蓋緊后搖勻1min8000g 4℃離心10分鐘取上清;在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL,再加入40μL試劑二,120μL試劑五,20μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于 580 nm測光吸收,記為A測定管。

注意:空白管和標準管只需要測定一次。

計算公式:

a.使用微量玻璃比色皿測定的計算公式如下

1)按蛋白濃度計算

活性單位定義:37℃每毫克蛋白每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

胃蛋白酶活性(nmol/min/mg prot= C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×稀釋倍數÷Cpr×V1÷T

=27500×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷Cpr

2)按樣本質量計算

活性單位定義:37℃每克組織每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

胃蛋白酶活性(nmol/min/g 鮮重)= C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×稀釋倍數÷W×V1÷V2÷T

=27500×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷W

C標準品:標準品濃度,0.5 μmol/mL酪氨酸;稀釋倍數:(20+100+100)÷20=11Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定;V1:加入反應體系中粗酶液體積(mL),20μL=2×10-2mLW:組織質量(g);V2:粗酶液總體積(mL),1mLT:催化反應時間(min),10min

b.使用96孔板測定的計算公式如下

((1)按蛋白濃度計算

活性單位定義:37℃每毫克蛋白每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

胃蛋白酶活性(nmol/min/mg prot= C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×稀釋倍數÷Cpr×V1÷T

=27500×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷Cpr

2)按樣本質量計算

活性單位定義:37℃每克組織每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

胃蛋白酶活性(nmol/min/g 鮮重)= C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×稀釋倍數÷W×V1÷V2÷T

=27500×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷W

C標準品:標準品濃度,0.5 μmol/mL酪氨酸;稀釋倍數:(20+100+100)÷20=11Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定;V1:加入反應體系中粗酶液體積(mL),20μL=2×10-2mLW:組織質量(g);V2:粗酶液總體積(mL),1mLT:催化反應時間(min),10min

注意事項

試劑三、試劑四、試劑五臨用前配制,配制好用不完的試劑4可保存一周。


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優利科(上海)生命科學有限公司

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