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堿性蛋白酶(AKP)活性測定試劑盒說明書

閱讀:461      發布時間:2023-04-04
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堿性蛋白酶Alkaline protease, AKP活性測定試劑盒說明書

                                                   微量法100T/48S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

AKP是指在堿性條件下催化蛋白質肽鍵水解的酶類,屬于絲氨酸蛋白酶。此外,該酶還能夠水解酯鍵、酰胺鍵,具有轉酯及轉肽的功能。該酶是主要工業用酶之一,廣泛應用于制藥、絲綢、食品、制革等行業。

 

測定原理:

在堿性條件下,AKP水解酪蛋白生成酪氨酸;在堿性條件下,酪氨酸還原磷鉬酸生成鎢藍;鎢藍在680nm有特征吸收峰,測定680nm吸光度增加速率,來計算AKP活性。

自備儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調式移液槍、0.5 mL EP管和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加5mL蒸餾水溶解。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑一,沸水浴中磁力攪拌溶解。(可在燒杯上蓋一層保鮮膜,注意觀察,避免水分全部蒸發,一般加熱15-30分鐘,該試劑為過飽和試劑,充分混勻后仍出現顆粒物不溶物不影響使用)。

試劑四:粉劑×1瓶, 4℃保存。臨用前加20mL蒸餾水溶解。

試劑五:液體5mL×1瓶,4℃保存。

標準品:液體1mL×1支,0.25μmol/mL標準酪氨酸溶液,4℃保存。

 

粗酶液提?。?/span>

1.        組織:按照組織質量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g,4離心10min,取上清,即粗酶液。

2.        血清或培養液:直接測定。

3.        細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g4,離心10min,取上清置于冰上待測。

 

測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到680 nm,蒸餾水調零。

2.試劑二、試劑三和試劑四置于40℃水浴保溫30min。

3. 對照管:0.5 mL EP管,加入20 μL粗酶液,40 μL試劑二,混勻后置于40℃水浴保溫10min;加入40μL試劑三,混勻后8000g ,4℃離心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,吸取200μL680nm測定光吸收,記為A對照管。

4. 測定管:0.5 mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL試劑三,混勻后置于40℃水浴保溫10min;加入40μL

 

試劑二,混勻后8000g,4℃離心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,吸取200μL680nm測定光吸收,記為A測定管。(注意與空白管不同,先加試劑三,后加試劑二)

5. 空白管:0.5 mL EP管,加入40μL蒸餾水,200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,吸取200μL680nm測定光吸收,記為A空白管。

6. 標準管:0.5 mL EP管,加入40μL標準品,200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,吸取200μL680nm測定光吸收,記為A標準管。

注意:空白管和標準管只需要測定一次。

 

計算公式:

1. 按照樣本蛋白濃度計算

AKP活性單位定義:30每毫克蛋白每分鐘水解產生1nmol酪氨酸1個酶活單位。

AKP活性(nmol/min /mg prot= C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷Cpr

 

2.按照樣本質量計算

AKP活性單位定義:30每克樣品每分鐘催化水解產生1 nmol酪氨酸為1個酶活單位。

AKP活性(nmol/min /g鮮重)=C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V反總÷W×V1÷V2÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷W

 

3. 按照液體體積計算

AKP活性單位定義:30每毫升樣品每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

AKP活性(nmol/min/mL=C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V反總÷V1÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)

4.         

5.        按照細胞數量計算

AKP活性單位定義:30104個細胞每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

AKP活性(nmol/min /104 cell=C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V反總÷(細胞數量×V1÷V2÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷細胞數量

C標準品:0.25 μ mol/mL標準酪氨酸溶液;V反總:酶促反應總體積,0.1mLCpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL);V1:加入反應體系中粗酶液體積(mL),0.02 mL;V2:提取液總體積(mL),1mL;T:催化反應時間(min),10minW:樣品質量(g)。

 

注意事項:

臨用前配制的試劑配置好后3天內使用完畢。

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優利科(上海)生命科學有限公司

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