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羥脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)試劑盒說(shuō)明書(shū)

閱讀:515      發(fā)布時(shí)間:2023-04-03
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羥脯氨酸HydroxyprolineHYP試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                      微量法100T/96S

 

    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

HYP是機(jī)體膠原蛋白主要成分之一,膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等,因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

 

測(cè)定原理:

樣品經(jīng)水解產(chǎn)生游離的HYP,進(jìn)一步被氯胺T氧化,氧化產(chǎn)物與對(duì)二甲氨基苯j(luò)ia醛反應(yīng),產(chǎn)生紅色化合物,在560nm處有特征吸收峰。通過(guò)測(cè)定樣品水解液560nm吸光值,可計(jì)算HYP含量。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、烘箱、玻璃管、離心機(jī)、水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、無(wú)水乙醇、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

組織提取液:6mol/L鹽酸,自備。濃鹽酸:H2OV/V= 1:1,室溫保存。

細(xì)胞提取液:液體100mL×1瓶,4保存。

試劑一:液體6mL×1瓶,4避光保存。

試劑二:液體6mL×1瓶,4避光保存。

 

羥脯氨酸提取:

1.        組織稱取約0.2g樣品于玻璃管,加入2mL的組織提取液,置于110烘箱,水解612小時(shí),用提取液定容至2mL12000g25,離心20min,取上清待測(cè)。

2.        細(xì)胞取約500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,加入1mL的細(xì)胞提取液,于高壓消毒器中15磅保持30min,自然降壓后待測(cè)。

3.        血清游離羥脯氨酸提取:取0.1mL血清,加入0.5mL無(wú)水乙醇使蛋白質(zhì)沉淀,8000g4℃離心5min。將上清倒入另一個(gè)EP管,氮吹或沸水浴將乙醇揮發(fā)干。冷卻后再加入0.2mL50%異丙醇,充分溶解混勻待測(cè)。

 

測(cè)定操作表:

1、   分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至560nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   操作表


對(duì)照管

測(cè)定管

樣本(µL


60

試劑一(µL

60

60

混勻,室溫靜置20min

試劑二(µL

60

60

H2OµL

180

120

混勻,6020min,取出后25靜置15 min,取200µL于微量石英比色皿/96孔板中檢測(cè)560nm吸光值。ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照

 

 

 

羥脯氨酸含量計(jì)算公式:

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=64.875x+ 0.0251R2=0.9991

1)按樣品重量計(jì)算

組織羥脯氨酸含量(mg/g 鮮重=ΔA-0.0251÷64.875×V反總÷(V÷V樣總×W)

                        = 0.154×ΔA-0.0251÷W

2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

細(xì)胞羥脯氨酸含量(mg/104 cell=ΔA-0.0251÷64.875×V反總÷V×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))= 0.077×ΔA-0.0251÷ 細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))

3)按血清體積計(jì)算

HYP含量(mg/mL=ΔA-0.0251÷ 64.875×V反總÷V×2

                 =0.154×ΔA-0.0251

V反總:反應(yīng)總體積,0.3 mLV樣:反應(yīng)中樣品體積,0.06mLV樣總:加入提取液體積, mLW:樣本重量,g

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=32.4375x+ 0.0251R2=0.9991

1)按樣品重量計(jì)算

HYP含量(mg/g 鮮重=ΔA-0.0251÷32.4375×V反總÷(V÷V樣總×W)

                = 0.308×ΔA-0.0251÷W

2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

HYP含量(mg/104 cell=ΔA-0.0251÷32.4375×V反總÷V×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))= 0.154×ΔA-0.0251÷細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))

3)按血清體積計(jì)算

HYP含量(mg/mL=ΔA-0.0251÷32.4375×V反總÷V×2

                 = 0.308×ΔA-0.0251

V反總:反應(yīng)總體積,0.3 mLV樣:反應(yīng)中樣品體積,0.06mLV樣總:加入提取液體積, mLW:樣本重量,g2,血清吹干后復(fù)溶的倍數(shù)。

 

注意事項(xiàng):

1、   吸光值大于0.8,樣品適當(dāng)稀釋再測(cè)定,注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、   試劑有一定的毒性,請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施,防止吸入或與皮膚接觸。

3、   Z低檢出限為3.8mg/L

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優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司

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