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轉基因植物CamV35S 啟動子核酸檢測試劑盒說明書

閱讀:2066      發布時間:2023-03-14
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轉基因植物CamV35S 啟動子核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

 

【產品名稱】

通用名稱:轉基因植物 CamV35S 啟動子核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法) Name :CamV35S Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】50T/盒

【預期用途】

自世界上di一例轉基因作物問世以來,轉基因作物迅猛發展。轉基因作物在抗蟲、抗病、抗逆、高產、優質等方面取得了一定成就,特別是與人密切相關的轉基因食品。為保護貿易、明確消費,各國政府均對安全監管提出了更高的要求。花椰菜花葉病毒 35S 啟動子(CamV35S)是轉基因作物中最經常用到的 2 個元件之一, 到目前為止,62%授權商業化種植的轉基因作物中含有 CamV35S。熒光 PCR 技術因其靈敏度高、特異性強等特點,在轉基因檢測中發揮了重要作用。

本試劑盒適用于檢測轉基因植物的 CamV35S 基因,用于篩查待檢測植物中是否含有 CamV35S 成分。

【檢驗原理】

本試劑盒根據 CamV35S 啟動子序列設計特異性引物和探針[1-2],用熒光 PCR 技術進行轉基因成分的檢測。

【試劑組成】


名          稱

規         格

酶液

50μL×1 管

CamV35S 反應液

500μL×2 管

CamV35S 陽性質控品

50μL ×1 管

陰性質控品

250μL ×1 管









注:

1)  不同批號試劑不能混用。

2)  試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。

【儲存條件及有效期】

-20℃避光保存、運輸、反復凍融不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

稱取 200g 樣品。

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標本運送應采用 0℃冰壺。

【使用方法】

1.  樣品處理(樣本處理區)

1.1  樣本前處理

固體樣本:用粉碎機或冷凍研磨儀將樣品研磨至細粉狀。

1.2  DNA 提取

推薦采用優利科(上海)生命科學有限公司生產的 DNA 提取試劑盒(離心柱提取

法),請按照試劑盒說明書進行操作。

2.  試劑配制(試劑準備區)

根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:

試劑

CamV35S   反應液

酶液

用量

20μL

1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,21uL/管。

3.  加樣(樣本處理區)

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL,加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4.  PCR 擴增(核酸擴增區)

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;

4.2 設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25ul;熒光通道選擇: 檢測通道

(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)選擇 NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3 推薦循環參數設置:


步驟

循環數

溫度

時間

收集熒光信號

1

1 cycle

95℃

10min

2

40 cycles

94℃

15sec

55℃

30sec

5.  結果分析判定

5.1  結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲線出現整體傾斜時,根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節),以及Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。

5.2  結果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數增長曲線;

可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤ 38,且曲線有明顯的增長曲線,判定為陽性,否則為陰性;

陰性:樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質控標準

陰性質控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;

陽性質控品:擴增曲線有明顯指數生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

7.  檢測方法的局限性

? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;

? 陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;

? 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;

? 不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;

? 試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或   定量檢測不準確的結果;

? 本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

 

【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行;

? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化,wan全混勻并短暫離心;

? 反應液應避光保存;

? 反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;

? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全   通則》進行處理。.

【參考文獻】

[1]  中國農業部. 1782 號公告-3-2012 轉基因植物及其產品成分檢測調控元件CamV 35S 啟動子、FMV 35S 啟動子、NOS 啟動子、NOS 終止子和 CaMV 35S 終止子定性 PCR 方法[S]. 北京: 科學出版社, 2012.

[2] 徐俊鋒, 王鵬飛, 李玥瑩, 等. 轉基因植物中CaMV35S 和tNOS 元件的 4 種定性PCR 檢測方法的比較. 農業生物技術學報, 2015 , 23 (3) :397-407.

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優利科(上海)生命科學有限公司

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