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準確定量分析基因治療制劑中轉染劑聚乙烯亞胺（PEI）殘留
生物制藥領域的浪潮，從單抗、雙抗、ADC 等抗體藥物的研發拓展到基因治療和細胞治療，以及現在異常火熱的 mRNA 疫苗領域和寡核苷酸藥物等。
聚乙烯亞胺（PEI）是一類陽離子聚合物轉染載體，在基因治療方法開發與生產中，可通過瞬時基因表達生產重組蛋白質，還可以在貼壁細胞系中用于病毒載體生產（腺相關病毒、慢病毒、腺病毒等）。具有基因轉染效率高，易于從溶酶體中逃逸等優點。但是 PEI 具有一定的毒性，其不易在體內生物降解的缺點受到了研發人員的關注，因此大家會嚴格控制 PEI 在基因治療制劑中的殘留，將潛在的風險降到低。為了滿足大家對 PEI 痕量殘留監控的急切需求，我們開發了 HPLC-ELSD 方法準確定量分析制劑中轉染劑 PEI 的殘留。
什么是 PEI？
PEI 是水溶性高分子聚合物的化學結構，沒有顯著的紫外吸收的基團，且帶有大量的正電荷。基于此特性，安捷倫推出液相色譜-蒸發光散射（HPLC-ELSD）聯用技術，適用于分析無法通過紫外檢測器進行測定的半揮發性及非揮發性化合物，特別是對于缺乏紫外吸收基團且不易揮發的 PEI 有較高的靈敏度和較好的重現性。
實驗樣品分析
準備 PEI 的對照品溶液，可以看到不同分子量的 PEI(PEI-25kDa和PEI-40kDa)在安捷倫 Poroshell HPH-C18 色譜柱上均有較好的保留。
圖 1 不同分子量 PEI 的色譜圖
PEI 為了準確定量實際樣品溶液中 PEI 的殘留，我們配制了一系列不同濃度的 PEI 對照品溶液，繪制標準曲線。
圖 2 一系列不同濃度的 PEI 色譜圖
圖 3 PEI 標準曲線（濃度范圍 0.01-0.1 mg/mL）
在此色譜條件下，PEI 在 ELSD 檢測器上有較高的靈敏度，濃度 0.001 mg/mL，可以得到 S/N=42，*測定制劑中痕量 PEI 殘留的要求。
圖 4 濃度 0.001 mg/mL PEI 的色譜圖
在實際樣品分析過程中，制劑中含量較高的緩沖鹽，以及前處理后殘留的其他物質在色譜柱上沒有保留，在死時間出峰，而 PEI 與色譜柱具有較強的作用力，通過快速的有機溶劑梯度變化進行洗脫，可以得到很好的分離，PEI 的加標回收率在 90%-110%之間。
圖 5 實際樣品及加標樣品色譜圖
該方法分離度好，靈敏度高，具有良好的線性關系、精密度和準確度，保留時間和峰面積的 RSD 分別在 0.1%和 1.6%范圍內。
利用上面的 HPLC-ELSD 分析方法，可以很好地滿足目前對制劑中痕量 PEI 殘留的分析，同時考慮到實際樣品基質比較復雜，在色譜柱之后和 ELSD 之前，安裝多功能閥，通過軟件設置切換時間，將 4min 之前高濃度基質切換到廢液中，4min 之后待測 PEI 切到 ELSD 中進行檢測。既準確測定了痕量 PEI，又避免了基質污染 ELSD 檢測器，保證了該方法的重現性。
推薦儀器
HPLC-ELSD 聯用技術采用全新 1290 Infinity II ELSD 檢測器，包括特殊光電倍增管以及激光器件，使其在靈敏度提高的同時，動態范圍提高 90 倍，而且其*的高精度玻璃噴頭設計為峰面積重現性提供了保證。
液相色譜-蒸發光散射檢測器
出色的靈敏度
新的 1290 Infinity II ELSD 檢測器配置性能出眾的激光光源，靈敏度比常規 ELSD 高出 10 倍，更適用于痕量分析。
極佳的穩定性
經過優化的安捷倫 ELSD 檢測器具有出色的穩定性，使大部分分析物獲得優異的重現性，提供可靠、準確的分析結果。
結語
與此同時，為滿足國內迅速發展的生物制藥行業對輔料、工藝殘留和遞送載體等分析提出的更高要求，安捷倫應用實驗室開發出一系列解決方案，包括 mRNA 疫苗和寡核苷酸藥物遞送載體的分析，治療性蛋白藥物制劑中表面活性劑吐溫 20 或吐溫 80 、穩定劑泊洛沙姆 188、凍干保護劑蔗糖、氨基酸等輔料成份的分析；以及消泡劑（二甲基硅油）和裂解劑（Triton X-100）等生產工藝殘留分析。
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1 采用 Agilent 1290 Infinity II ELSD 同時定量分析治療性蛋白藥物制劑中吐溫 80 （聚山梨酯 80）和泊洛沙姆 188
2 使用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器 (HPLC-ELSD) 對生物制劑中的泊洛沙姆 188 進行定量分析
3 安捷倫生物制藥輔料及生產工藝殘留分析解決方案
4 使用反相高效液相色譜-蒸發光散射法 (RP-HPLC-ELSD) 對 PEG 偶聯重組蛋白注射劑中的吐溫 20（聚山梨酯 20）進行分析