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北京博奧森生物技術有限公司

內參抗體的選擇:關鍵因素與應用指南

時間:2024-8-7 閱讀:1388
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  在生物學和醫學研究領域中,Western Blot(免疫印跡試驗)是一種常用的技術,用于檢測和比較不同條件下蛋白質的表達量。在這一過程中,內參抗體的選擇至關重要,因為它直接影響到實驗結果的準確性和可靠性。本文將探討內參抗體選擇的關鍵因素及其應用指南。
  一、內參抗體的定義與重要性
  內參抗體,也稱為內部參照抗體,是用于Western Blot實驗中校正和標準化實驗結果的輔助抗體。它們通常由管家基因編碼,這類基因在各組織和細胞中的表達相對恒定,不受外部條件變化的顯著影響。內參抗體不僅用于校正蛋白質定量和上樣過程中存在的實驗誤差,還作為空白對照,監測整個Western Blot實驗的體系是否正常。
  二、選擇內參抗體的關鍵因素
  1.物種來源
  -哺乳動物組織或細胞樣本:常用的內參包括β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3等。
  -植物來源樣本:可以選擇Plant actin、Rubisco等內參。
  -其他稀少物種:通過查詢相關文獻或數據庫,選擇合適的蛋白作為內參。
  2.目的蛋白的分子量
  -內參蛋白的分子量應與目的蛋白相差5kDa以上,以防止檢測時信號重疊。例如,若目的蛋白分子量為45kDa,則不宜選擇β-actin(42kDa)作為內參,而應考慮GAPDH(36kDa)或β-tubulin(55kDa)。
  3.實驗環境
  -考慮實驗樣本是否受到特定生理條件(如缺氧、糖尿病)或實驗處理(如抗癌藥物)的影響,這些條件可能會改變內參蛋白的表達量。例如,在糖尿病研究中,GAPDH的表達可能增高,不適合作為內參。
  4.蛋白表達位置
  -不同細胞器或組織部位的內參蛋白不同。例如,核蛋白檢測時,可選擇Lamin A、Lamin B、Histone H3等核內參;線粒體蛋白檢測時,可選擇VDAC1和COX IV作為內參。
  5.實驗目的
  -在細胞增殖相關實驗中,c-Jun由于自身表達變化,不適合作為內參;在凋亡實驗中,TBP、Lamin等也不適合作為核內參。

 

  三、應用指南
  1.實驗準備
  -在設計實驗方案時,應綜合考慮上述因素,并查詢相關文獻,選擇最合適的內參抗體。
  -確保實驗過程中操作規范,避免由于技術原因導致的誤差。
  2.實驗過程
  -在Western Blot實驗中,按照常規步驟進行蛋白提取、電泳、轉膜和抗體孵育。
  -若目的蛋白與內參蛋白分子量差異不大,可采用分步孵育的方法,即先檢測目的蛋白,然后洗去膜上的抗體,再孵育內參抗體。
  3.結果分析
  -觀察內參蛋白和目的蛋白的條帶強度和位置,確保實驗結果的準確性和可靠性。
  -若內參表達出現異常,應及時分析原因,并考慮更換內參抗體。
  4.注意事項
  -內參抗體的選擇應具有通用性和穩定性,以確保實驗結果的可重復性和可比性。
  -在處理特殊樣本(如分泌液、紅細胞等)時,應選擇合適的內參蛋白或采用其他方法作為參照。
  內參抗體的選擇是Western Blot實驗中一個至關重要的環節。通過綜合考慮物種來源、目的蛋白分子量、實驗環境和實驗目的等因素,選擇最合適的內參抗體,可以顯著提高實驗結果的準確性和可靠性。在實驗過程中,應嚴格遵循操作規范,注意細節處理,確保實驗結果的準確性和可信度。

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