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分子克隆實驗---第三章:測序結果解讀

時間:2025/3/31閱讀:601
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一代測序是克隆實驗中常見的下游實驗。現代 DNA 測序技術源于 Sanger 鏈末端終止測序法,其工作原理與 Sanger 測序不同的是 4 組反應的雙脫氧核苷酸分別用不同的熒光分子標記,每個試管的產物在光激發下發出不同顏色的熒光,延伸反應和鏈終止完成后,將全部 4 組反應物混合,在同一泳道進行凝膠電泳,通過激光束激發熒光分析不同位置堿基的熒光顏色完成測序分析。


一般情況下,測序信號文件多為 *.ab1 文件,該文件能夠得到每個堿基的測序峰型及整體質量;*.seq 文件則為 ab1 文件導出得到的測序結果序列,ab1 文件中已具有堿基序列信息,因此 *.seq 文件可不作重點關注。


一代測序的每次測序反應能夠產生約 600-900bp 堿基信息,測序開始的 5 端約 50bp 左右的測序信號不穩定,檢測 800bp 左右之后信號開始衰減,各種波之間有重疊等情況。這部分結果信息不準確,不建議參考使用。

理想狀態的測序信號應當是獨立單一的峰形信號,波峰與波谷清晰,峰與峰之間的距離均勻,波峰底部沒有雜峰干擾,此時得到的堿基信息可信度超高;測序信號出現雙峰、套峰等情況時,該處堿基信息可信度低,需要其他測序結果共同比對分析



       

測序問題的主要原因:
◆ 套峰
a) 全雙峰:多引物結合位點(菌液、質粒);非特異擴增(PCR 產物);
b) 前雙峰:多引物結合位點,其中一套模板測序中斷(菌液、質粒);多引物結合位點(PCR
擴增未純化產物);引物二聚體或小片段干擾(PCR 產物純化非切膠樣品);
c) 中間雙峰:非單克隆(菌液、質粒);堿基缺失或等位基因雙模板(PCR 擴增未純化產物);
d) 后雙峰:非單克隆(菌液、質粒);堿基缺失(PCR 產物)。


◆ 測序信號

a) 無信號:引物結合位點不存在或被破壞;
b) 信號差:引物或模板的質量不高,或引物和模板匹配性低,或樣本濃度偏低;
c) 信號衰減:可能因測序序列的特殊結構導致,如 Poly 結構、重復序列、回文結構、發卡結構、GC 富集、AT 富集等;若為正常峰形后逐漸衰減,可能模板反應量不足;
d) 信號中斷:模板存在高級結構,導致 dNTP 和 ddNTP 在某位點無法與模板結合;
e) 測序移碼:測序開端移碼可能是引物降解,局部移碼可能樣本存在高級結構;

f) 測序底峰干擾:可能測序引物不純;可能測序樣品不純混有正、反向引物。


優化方案:套峰

二聚體、小片段干擾:凝膠電泳,切膠純化回收;                                                          
多引物結合位點:更換引物測序或反向測通;
堿基缺失:構建單克隆后測序;
非單克隆:在載體構建克隆正確下重新挑取單克隆測序;
非特異性擴增:優化反應條件重新制備;

等位基因雙模板:構建單克隆后測序。


測序信號

無信號:更換引物或重新提供樣品測序;
信號差:提供高質量樣品測序;
信號衰減:特殊結構導致衰減,建議反向測序拼接;若正常峰形后逐漸衰減:提供高質量樣品;
測序中斷:建議反向測序測通;
測序底峰干擾:重新制備模板,引物 PAGE 膠純化。


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