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Trizol法和柱式法RNA提取的實驗流程和注意事項

時間:2024/1/23閱讀:1660
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實驗原理:

(一)Trizol 法

Trizol是一種酸性試劑,能從細胞和組織中快速分離RNA,其主要成分為異硫氰酸胍(GITC)和苯酚。裂解細胞后,GITC能使蛋白質和RNase變性,有利于保護RNA的完整性;加入氯仿離心后,樣品分為水相和有機相,RNA存在于上層水相中,而DNA和蛋白質則存在于中間層及下層有機相中,從而達到分離的目的。簡單來講就是裂解細胞使RNA得以釋放,加之有機溶劑使RNA與DNA、蛋白質分離,并進一步純化得到RNA的過程。


試劑、儀器與耗材:

Trizol試劑、氯仿、異丙醇、75%乙醇、RNase free Water、低溫冷凍離心機、勻漿器或組織研磨器、渦旋振蕩器、金屬浴、微量移液器、通風櫥、計時器、1.5ml EP管等。


提取步驟:

1.樣品處理:

細胞:貼壁細胞每106細胞加入1ml裂解液,吹打混勻。

懸浮細胞:植物、動物、酵母每10^6細胞加入1ml裂解液。

細菌細胞每107細胞加入1ml裂解液混勻。

組織:新鮮或-70℃凍存100mg組織加1ml裂解液,勻漿處理。


2.室溫放置5min,使核酸蛋白復合物全部分離;

3.向勻漿樣品中加入0.2ml的氯仿,蓋好管蓋,劇烈振蕩15s,室溫放置3-5min;

4.2-8℃,12000rpm離心10min。RNA主要存在于上層水相中把水相轉移至新的EP管中(注:不可吸到沉淀);

5.吸附柱前處理:在吸附柱中加入500ul洗柱液,室溫放置2min,2-8℃,12000rpm離心2min,棄廢液(小Tips:此步可以在第四步離心還剩2min左右的時候進行,這樣第四步離心結束就可以直接進行洗柱,而不需要再等時間);

6.在收集的上清中加入200ul無水乙醇混勻,加入吸附柱中靜置2min,2-8℃,12000rpm離心2min,棄廢液;

7.向吸附柱中加入600ul漂洗液(注:新買的試劑盒中漂洗液還需要加入一定量的無水乙醇,此步一定要確認漂洗液是否加入無水乙醇),2-8℃,12000rpm離心2min,棄廢液;

8.向吸附柱中加入600ul漂洗液,2-8℃,12000rpm離心2min,棄廢液(注:漂洗液在7-8步共加了兩次哦);

9.12000rpm離心2min,棄掉收集管,將吸附柱置于室溫數分鐘(10-15min)以去除殘留的漂洗液(注:最好在通風櫥進行,以免RNA酶對RNA的降解;通風櫥在使用前也可先紫外30min);

10.將吸附柱放入新管中,向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O(通常取中間值),室溫放置5min,12000rpm室溫離心2min即可得到RNA溶液(注:所有步驟中僅最后一步離心是在室溫,其余均在2-8℃,因此,前幾步離心拿出樣品后一定要及時關上離心機蓋子,以免升溫,而在第9步離心結束后就可以打開離心機蓋子使其快速升至室溫)。

四、 注意事項

1.佩戴手套、口罩,消毒操作臺,杜絕外源酶的污染;

2.所用試劑耗材必須無酶化,有條件者可以直接購買,否則就要做好高壓滅菌的工作;

3.得到RNA溶液后可保存于-80℃,避免反復凍融,放置時間不可過長;

4.對于組織RNA的提取,一定要充分勻漿處理以使RNA充分釋放出來。

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