1) 需要脫氧核苷三磷酸：
進行 DNA 合成必須具備的 2 個關鍵底物之一，即 4 種脫氧核苷三磷酸——dGTP、dCTP、dATP、dTTP。通常商品化 PCR 酶會提供這 4 種脫氧核苷三磷酸的混合物 dNTP。
2) 需要引物-模板接頭：
DNA 合成的第二個重要底物是一具有特定序列的雙鏈 DNA，稱為引物-模板接頭，即指 導互補脫氧核苷酸添加的單鏈 DNA 模板和與模板互補但比模板短的一小段序列。
較長的 DNA 鏈有一個與引物退火的區域和一個毗鄰的單鏈 DNA 區，此區作為 DNA 合成的模板；較短的引物與較長的 DNA 鏈退火，且必須有與模板單鏈 DNA 區毗鄰的游離 的 3’-OH，當新核苷酸加入時引物的 3’-OH 端得以延伸。一般而言，引物-模板接頭的引物部分才是 DNA 合成的底物，而模板僅僅提供選擇哪種核苷酸進行添加的必要信息。
因此我們在設置 PCR 反應程序時第一步是高溫變性（一般會設置成 95℃變性），就是為了把雙鏈的模板變性成單鏈，第二步是降低溫度，是為了讓引物能互補匹配到單鏈模板上。
3) 需要 DNA 聚合酶：
DNA 聚合酶的三維結構類似于一只右手。手掌域是催化活性位點，可以催化任意 4 種脫氧核苷三磷酸的添加，這一區域結合 2 個二價金屬離子（通常是 Mg2+或 Zn2+）。其中一個 金屬離子降低 3’-OH 對其氫的親和力，這會產生一個準備對引入 dNTP 上的 α-磷酸進行親核 攻擊的 3’O-。第二個金屬離子與 dNTP 的 β-和 γ-磷酸負電荷協同作用，穩定由引物和引入核苷酸連接在一起時所產生的焦磷酸。所以我們在 PCR 時，反應體系里加入適量的 Mg2+是十分重要的，添加的量少導致 PCR 酶無法發揮最大活性，添加太多則降低酶反應的特異性。
DNA 聚合酶是一種延伸酶，其催化是快速的。DNA 合成的速度主要取決于 DNA 聚合酶 的延伸能力。在實際應用中，一般的Taq酶的延伸速度大致是擴增產物在2kb以內是1kb/min。 擴增產物超過2kb 的部分可以以500bp/min 來計算。比如擴增2kb，延伸時間就設置成2min， 而擴增 3kb，就可以把延伸時間設置成 4min。也有延伸能力更強的酶，那么延伸時間就按產 品說明書描述的來設置。
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