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深圳市安培生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第5年

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PEG 介導(dǎo)的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合

時(shí)間:2023/1/12閱讀:1851
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簡(jiǎn)介

細(xì)胞融合的方法有生物法、化學(xué)法和物理法。化學(xué)法常用的是化學(xué)誘導(dǎo)劑聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)結(jié)合高 pH、高鈣離子法。該法操作方便,目前已成為人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的主要手段。

原理

PEG 介導(dǎo)的細(xì)胞融合的基本原理是利用 PEG 使細(xì)胞相互接觸部位的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生重排,加之膜脂雙層的相互親和以及彼此間表面張力的作用,引起相鄰質(zhì)膜在修復(fù)時(shí)相互合并在一起,導(dǎo)致細(xì)胞之間發(fā)生融合。PEG 介導(dǎo)的細(xì)胞融合率受下述因素影響。


① PEG 的分子量與濃度:分子量及其濃度與融合率成正比;但分子量越大、濃度越高,對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大。為了兼顧二者,常用的 PEG 相對(duì)分子質(zhì)量為 1000~4000,濃度為 40%~60%。


② PEG 的 pH 值:pH 值在 8.0~8.2 之間融合效-率-最-高。


③ 融合時(shí)的溫度:由于生物膜的流動(dòng)性與溫度成正比,在細(xì)胞可承受的溫度范圍內(nèi)適當(dāng)提高溫度,可提高融合率。


④ 處理時(shí)間:處理時(shí)間越長(zhǎng),融合率越高,但對(duì)細(xì)胞的毒害也越大。故一般將處理時(shí)間限制在 1.0~1.5 min 之內(nèi)。若融合后不繼續(xù)培養(yǎng),可將處理時(shí)間延長(zhǎng)至 20 min。

用途

細(xì)胞融合不僅可用于核質(zhì)關(guān)系、基因定位、體細(xì)胞的遺傳和發(fā)育等生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究,而且在生產(chǎn)實(shí)踐上還有重要的應(yīng)用價(jià)值,目前已成功應(yīng)用于單克隆抗體的制備、新品種的培養(yǎng)、性狀的改良、疾病的治療和潛伏病毒的研究等領(lǐng)域。

材料與儀器

器材:


① 普通低速離心機(jī)


② 恒溫水浴鍋


③ 普通光學(xué)顯微鏡


④ 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板


⑤ 天平、剪刀、鑷子、50 ml 無(wú)菌離心管、96 孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管、蓋玻片、載玻片


試劑:


① 材料:鼠、培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞


② PBS


③ HAT 選擇培養(yǎng)液


④ HT 培養(yǎng)液


⑤ PEG(M,=4000)(50%)

步驟

PEG 介導(dǎo)的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的基本過(guò)程可分為如下幾步:


(一)試劑配制


(1)HAT 選擇培養(yǎng)液 常用兩種儲(chǔ)存液(100xHT 和 100xA)來(lái)稀釋配制 HAT 培養(yǎng)液。


① 100xHT 稱取次黃-嘌-呤 136.1 mg 和胸腺嘧啶核苷 38.8 mg,加細(xì)胞培養(yǎng)用水至 100 ml。若溶解不佳,加熱(70 ℃)助溶。100 倍儲(chǔ)存液中,次黃-嘌-呤濃度為 10 mmol/L,胸苷為 1.6 mmol/L。0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌,分裝,-20 ℃ 保存,可保存 1 年。


② 100xA 稱取氨基蝶呤 1.76 mg,溶解于細(xì)胞培養(yǎng)用水中。加 1.0 mol/L NaOH 0.5 ml 助溶,再用 1 mol/L HC1 將 pH 調(diào)回至中性,定容至 100 ml。注意勿調(diào)成酸性,因?yàn)榘被蕦?duì)酸敏感。100 倍儲(chǔ)存液中氨基蝶呤的濃度為 0.04 mmol/L。0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌,分裝,-20 ℃ 保存,可保存 1 年。


③ 將 100xHT 和 100xA 各按 1:100 比例加到含小牛血清的完-全培養(yǎng)基中,即成 HAT 選擇培養(yǎng)液。其中各成分的最終濃度分別為:H,1x10-4 mol/L;A,4x10-7 mol/L;T,1.6x10-5 mol/L。 


(2)100xHT 培養(yǎng)液 10 mmol/L 次黃-嘌-呤鈉鹽;1.6 mmol/L 胸腺嘧啶脫氧核苷。


(二)準(zhǔn)備脾細(xì)胞


(1)處死動(dòng)物并用乙醇擦拭腹部,剖開(kāi)腹部暴露脾臟。


(2)用滅菌的鑷子和剪刀取出脾臟,置于一盛有 50 ml 滅菌 PBS 的燒杯中,洗去血污。


(3)把脾臟移入一盛有 20 ml 滅菌 PBS 的培養(yǎng)皿中。除去所有的多余組織和脂肪,并用 PBS 沖洗脾臟。


(4)把脾臟移入盛有 20 ml 滅菌 PBS 的培養(yǎng)皿,用滅菌的剪刀、鑷子剪碎組織,制成單細(xì)胞懸液。


(5)收集細(xì)胞于 50 ml 離心管,用 10 ml 滅菌的 PBS 清洗培養(yǎng)皿并轉(zhuǎn)移入離心管。靜置 1 min。


(6)小心把細(xì)胞懸液移入一新的離心管,不要讓管底的組織塊一并轉(zhuǎn)入。


(7)用 10 ml 滅菌的 PBS 清洗有組織塊的離心管,靜置 1 min 后小心移出細(xì)胞懸液,并和上一次的細(xì)胞懸液混合。


(8)室溫下以 800 g 離心 5 min。


(9)小心棄上清液。用 50 ml 滅菌的 PBS 重懸細(xì)胞,重復(fù)離心。


(10)小心棄上清液。在 10 ml 滅菌的 PBS 中重懸細(xì)胞。


(11)取 1 滴進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。


(三)準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞


(1)從 2~4 個(gè)培養(yǎng)瓶中收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞。


(2)用滅菌的 PBS 清洗細(xì)胞,800 g 離心 5 min。


(3)重復(fù)洗滌、離心一次。


(4)用 10 ml 滅菌的 PBS 重懸細(xì)胞。


(5)取 1 滴進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。


(四)融合步驟


(1)以 3:1~5:1(脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞)的比例在 50 ml 離心管中混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)約為 106)。室溫下 800 g 離心 5 min。


(2)盡可能地棄去上清液。輕叩管底使沉淀松動(dòng),置 37 ℃(39 ℃ 更佳)水浴中預(yù)溫。


(3)緩慢逐滴加入 1 ml 37 ℃ 預(yù)溫的 50% PEG 溶液,邊加邊輕搖混勻,加完后用吸管輕輕吹打混勻。37 ℃ 靜置 1 min。


(4)用 20 ml 滅菌的 PBS 稀釋 PEG。注意動(dòng)作一定要緩慢,尤其是開(kāi)始稀釋時(shí)(最初 1 ml 在 1 min 內(nèi)加完,之后可加快速度)。800 g 離心 5 min,棄上清液。


(5)重復(fù)洗滌、離心一次。


(6)棄上清。在 HAT 培養(yǎng)液中重懸沉淀,使細(xì)胞密度為 5x105 個(gè)/ml


(7)轉(zhuǎn)入 96 孔培養(yǎng)板,每孔 0.2 ml。在 CO2 培養(yǎng)箱中 37 ℃ 培養(yǎng)

 5~7 d,其間根據(jù)需要換 HAT 培養(yǎng)液。


(8)觀察細(xì)胞融合結(jié)果。


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安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶,提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑;inviCELL™Platelet lysate無(wú)動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn),包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等,為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù);提供以植物生物為平臺(tái)基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品;提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專(zhuān)注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù),努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。


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