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細胞周期檢測(流式細胞術)

時間:2022/10/18閱讀:2767
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原理


流式細胞周期檢測是一種常見的檢測細胞增殖情況的方法之一,細胞在不同周期時,其內的DNA含量不同。碘化丙啶(PI)作為一種核酸嵌入型染料,能夠進入固定后的細胞中,與細胞內的核酸結合,其熒光強度與DNA含量成正比。通過流式細胞儀檢測不同細胞中的熒光強度,從而判定不同組別中細胞周期發(fā)生的變化。


用途


檢測不同組別或處理對某種細胞周期的改變。


材料與儀器


【器材】
流式細胞儀、移液器、槍頭、離心管、離心機、流式細胞儀、水浴鍋、流式管、濾頭;
【試劑】0.25% 胰蛋白酶溶液、PBS、RNA酶、PI染液、70% 乙醇溶液(建議提前放入負二十預冷);


步驟


1.以腫瘤細胞為例,將正常生長的對照或處理組腫瘤細胞計數,每組取2×105-3×105個細胞鋪板,待細胞貼壁后,將正常培養(yǎng)基替換為無血清1640培養(yǎng)基,同步化20 h,使得所有細胞都進入相同的細胞周期時期;同步完后,將培養(yǎng)基重新替換為正常含血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;
 
2.用不含EDTA的胰酶將細胞消化,收集細胞,300 g,離心3 min;用吸引器去除培養(yǎng)基,用PBS清洗細胞一次,再次300 g,離心3 min;去除PBS,用提前預冷的70%酒精重懸細胞沉淀,4℃固定過夜;
 
3.4℃,1000 g,離心3-5 min,去除酒精,用PBS清洗3遍,最后一遍去除PBS;加入300 μL PBS,輕輕吹打,重懸細胞沉淀,加入相應量的Rnase至終濃度100 μg/mL,37 ℃水浴鍋中消化30 min;
 
4.上機前加入PI(5 mg/mL)至終濃度50 μg/mL,避光孵育15 min;孵育完后,過300目細胞篩,上機檢測;
 
5.分析數據。
  


注意事項


1. PI為致癌物質,避免用手直接接觸。

2. 細胞數目應該達到2x104個,細胞數目過少影響實驗結果的準確性。
 
3.鋪板的細胞數量以收獲細胞時有足夠的生長空間來動態(tài)調節(jié),現在的流式細胞儀靈敏度很高,不需要太多的細胞。
 
4. 在制備時,要清洗干凈酒精,特別注意清洗過程中細胞的損失。離心次數不宜過多,防止細胞丟失。
 
5. 可以用未處理的細胞調試流式細胞儀。
 
6.胰酶不加EDTA

 


常見問題


Q:酒精固定后細胞難以沉淀下來,導致細胞丟失較多;

A:可適當延長離心時間和轉速。


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