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同學(xué)A：

使用細(xì)胞細(xì)胞包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)板，將傳代或復(fù)蘇凍存的人間充質(zhì)干細(xì)胞接種到6孔板上，密度為2×105 -3×105 cells/cm2或2×105 -3×105 cells/孔，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時，小心的將孔內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基吸掉，向6孔板中加入2mL人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基（此套裝包含基礎(chǔ)500ml，脂肪細(xì)胞分化因子：5ml,干細(xì)胞生長維持因子：5ml,胎牛血清：25ml ),以此記為第0天。

一、細(xì)胞誘導(dǎo)前可使用多聚賴氨酸溶液進(jìn)行細(xì)胞包被，以便細(xì)胞更好的進(jìn)行貼壁。

二、每隔1-2天更換新鮮的人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基；

注意：為防止脂肪細(xì)胞脫落，建議誘導(dǎo)過程中出現(xiàn)大量脂肪細(xì)胞結(jié)節(jié)之后，換液形式變?yōu)槊刻煲淮伟肓繐Q液。

三、誘導(dǎo)14-21天期間，視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長情況進(jìn)行染色。

以下是總結(jié)的染色方法

脂肪油紅染色，有的是動物/人體脂肪組織切片，或細(xì)胞爬片。各有操作稍有差異。

一

*成熟飽滿的脂肪細(xì)胞，容易破裂，脂滴泄漏，所以壓片，切片都要考慮到這個問題。

二

細(xì)胞爬片細(xì)胞溶液脫落，特別是脂滴大的。操作務(wù)必要輕柔。不要把細(xì)胞沖掉。

三

如果做脂肪組織冰凍切片，冰凍切片要適當(dāng)厚一些，一般為10-15µm，切片太薄容易導(dǎo)致脂肪流失

四

如果培養(yǎng)載體為塑料制品，hoechst33342染核的話，塑料板自發(fā)熒光也為藍(lán)色，必須考慮波長，激發(fā)波長/發(fā)射波長=485nm/572nm

誘導(dǎo)的小鼠MMSC-BM的成脂肪細(xì)胞

五

染色步驟：

（1）先小心輕緩倒去培養(yǎng)液。
（2）用pbs輕緩漂洗。
（3）加10%中性甲醛或者95%以上的酒精固定30min以上
（4）稀釋改良型即用油紅染色試劑盒，油紅：PBS＝3:2，室溫放置10min
（5）染色10-20min左右，加的體積覆蓋住板底即可，如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml。
（6）脫色，用75%酒精/60%異丙醇漂洗，除去多余的染料

（7）復(fù)染，淡蘇木染色1/5分鐘，pbs漂洗（這一步不做也可，看試驗(yàn)需要，并且蘇木素會把胞漿染紅，如要顯示核， hoechst33342也可以，濃度5微克/毫升染10分鐘即可把核染上）。
（8）甘油明膠封片（封片后可長期保存）。

（9）若不用明膠封片，請盡快拍照。

同學(xué)B：

油紅O染色試劑盒在傳代培養(yǎng)中，接種密度是影響體外培養(yǎng)間質(zhì)干細(xì)胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時，間質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯提高，而誘導(dǎo)細(xì)胞分化時則需要較高的細(xì)胞密度，這可能與分化時細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。而在培養(yǎng)過程中，若細(xì)胞過度融合會促進(jìn)其分化趨向，故要保持干細(xì)胞未分化狀態(tài)，要及時傳代。

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安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。

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