成人做爰免费视频免费看_成人a级高清视频在线观看,成人a大片在线观看,成人a大片高清在线观看,成人av在线播放,一a一级片,一级黄 中国色 片,一级黄 色蝶 片,一级黄色 片生活片

深圳市安培生物科技有限公司
中級會員 | 第5年

19126518388

血清系列
細胞轉染
支原體清除
細胞凍存
實驗耗材
分子試劑
細胞增殖與凋亡
Biozellen系列
培養基
ELISA試劑盒
TOYOBO(東洋紡)
ZYMO RESEARCH
Greiner(格瑞納)
IKA(艾卡)
化學發光底物(ECL)
PROSPEC系列
Epigentek系列
微生物檢測
細胞生物學
Corning康寧
解離試劑
細胞類-實驗耗材
原代細胞
植物檢測系列試劑盒
SERANA
BSA
細胞系
生化試劑盒
環境檢測系列試劑盒(AKEN)
類器官培養
緩沖器和解決方案
生物三凝膠基質
細胞因子分子
生物樣本庫
蛋白研究系列
修飾檢測試劑盒

如何從哺乳動物細胞或組織分離DNA

時間:2021/11/18閱讀:1466
分享:

材料與儀器

細胞
TBS 抽提緩沖液
離心管

步驟

1. 根據樣品類型,從下列方法中選一個作為步驟 1 進行操作。

(1) 細胞樣品

① 單層培養的細胞

以用冰預冷的 TBS 將單層細胞洗滌 2 次,用刮棒把細胞刮入約 0.5 ml 的 TBS 中,將細胞懸液轉移到冰浴的離心管中,用 1 ml TBS 沖洗培養皿,并入離心管中的細胞懸液。于 4℃ 以 1500 g 離心 10 分鐘以收獲細胞。用 5~10 倍體積經冰預冷的 TBS 重懸細胞并再度離心。用 TE ( pH 8.0)重懸細胞,使細胞密度為 5x107 細胞/ml,轉移至一個三角燒瓶中(1 ml 細胞懸液用 50 ml 燒瓶;2 ml 則用 100 ml 燒瓶;余類推)。每毫升細胞懸液加入 10 ml 抽提緩沖液,在 37℃ 孵育 1 小時,隨后進行步驟 2。

抽提緩沖液:

10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0

0.1 mol/L EDTA,pH 8.0

20 ug/ml 胰 RNA 酶

0.5% SDS

② 懸浮生長的細胞

于 4℃ 以 1500 g 離心 10 分鐘以收獲細胞。用與原培養液等體積的經過冰預冷的 TBS 重懸細胞,再次離心收獲細胞并重復洗滌步驟。用 pH 8.0 的 TE 重懸細胞使密度為 5x107 細胞/ml。將懸液轉移至大小適當的燒瓶中,依前聽述加入抽提緩沖液并孵育。

(2) 組織標本

將剛切制的組織碎塊放到盛有液氮的 Waring 絞切器的不銹鋼杯中,以最高速度絞切至組織粉碎成為粉末。待液氮蒸發,將組織碎末一點一點地加入到盛有近 10 倍體積抽提緩沖液(如前)的燒杯中。使粉末分散在抽提緩沖液的表面,面后振搖燒杯使粉末浸沒。待其*分散于溶液中后,將該溶液轉移至 50 ml 離心管中,37℃ 孵育 1 小時。隨后進行步驟 2。

(3) 血液標本

收集約 20 ml 新鮮血液,加入裝有 3.5 ml 酸性檸檬酸葡萄糖溶液 B ( ACD ) 的試管中 。這一抗凝劑優于 EDTA,因為它在血液貯存過程中更能保存高分子量 DNA。這些血液在制備 DNA 前可于 0℃ 保存數天或于 -70℃ 長期保存。配制 ACD 時,混合:

檸檬酸              0.48 g

檸檬酸鈉          1.32 g

葡萄糖             1.47 g

加水至 100 ml

用作抗凝劑時,每 6 ml 新鮮血液中加入 1 ml ACD。

新鮮血液(20 ml):以 1300 g 離心 15 分鐘,棄上層血漿,用巴斯德吸管將淡黃層小心移到另一管中并再次離心。淡黃層即為密度不均一的白細胞寬帶。將經第二次離心的淡黃層重懸于 15 ml 抽提緩沖液中,37℃ 孵育 1 小時,隨后進行步驟 2。

凍藏血液(20 ml):在室溫水浴中融化,移至離心管中,用等體積 PBS 稀釋;隨后于室溫以 3500 g 離心 15 分鐘并棄去上清液,其中含有已溶解的紅細胞用 15 ml 抽提緩沖液重懸沉淀物;37℃ 孵育 1 小時,隨后進行步驟 2。

2. 蛋白酶 K 至終濃度為 100 ug/ml,用玻棒溫和地將酶混入黏稠的溶液中。

3. 裂解細胞的懸液置于 50℃ 水浴中 3 小時,不時懸動該黏稠溶液。

4. 溶液冷卻至室溫,如有必要就將溶液倒入離心管。加等體積經 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)平衡的酚,緩慢地來回顛倒離心管 10 分鐘以輕輕地混合兩相 。如此時兩相未能混合形成乳濁液,則將離心管置于旋轉器上 1 小時,于室溫以 5000 g 離心 15 分鐘,使兩相分開。

5. 大口徑移液管(出口直徑為 0.3 cm ) 將黏稠的水相移至一潔凈的離心管中并用酚重復抽提 2 次。

6. 分離高分子量 DNA ( 約 200 kb ):第三次酚抽提后用全部水相于 4℃ 對 4 L 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)、10 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 溶液透析 4 次,直至透析液的 OD270 值小于 0.05。讓透析袋留有使樣品體積增至 1.5~2.0 倍體積的空間。下轉步驟7。

分離大小為 100~150 kb 的 DNA:第三次酚抽提后,將全部水相移至另一離心管中并加 0.2 倍體積的 10 mol/L 乙酸銨。在室溫下加 2 倍體積乙醇并轉動離心管使溶液充分混合。DNA 立即形成沉淀,通常可用制成 U 形并經封口的巴斯德吸管將沉淀從乙醇溶液中移出。而大部分污染的寡聚核糖核苷酸仍留在乙醇溶液中。如果 DNA 沉淀成為碎片,則在吊桶式轉頭中于室溫以 5000 g 離心 5 分鐘收集 DNA。用 70% 乙醇洗滌 DNA 沉淀 2 次,并按上述條件離心收集 DNA。盡可能*地除去 70% 乙醇,于室溫將 DNA 沉淀置于一個敞幵的管內,直至可見的痕量乙醇揮發殆盡。不要使 DNA 沉淀*干燥,否則極難溶解。

大約按每 5x106 細胞加 1 ml TE (pH 8.0 )。將管子放在搖床平臺上慢慢搖動直至 DNA *溶解。這通常需要 12~24 小時。

7. 測定 DNA 樣品在 260 nm 和 280 nm 處的光吸收。A260 與 A280 之比應大于 1.75。低于此值則表明制備物中留有大量蛋白質。在這種情況下,應加入 SDS 至終濃度為 0.5%,并重復步驟 2~7。

8. 計算 DNA 濃度,進行脈沖電場凝膠電泳或通過鋪在 1% 瓊脂糖支持層上的 0.3% 瓊脂糖凝膠電泳分析小量樣品。大于 100 kb 的 DNA,其遷移率應該比完整的 λ 噬菌體 DNA 的線性二聚體分子慢。將 DNA 貯存在 4℃。


會員登錄

×

請輸入賬號

請輸入密碼

=

請輸驗證碼

收藏該商鋪

X
該信息已收藏!
標簽:
保存成功

(空格分隔,最多3個,單個標簽最多10個字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我們將在第一時間回復您~
撥打電話
在線留言
主站蜘蛛池模板: 2021国产精品视频一区| 国产精品99久久免费黑人人妻| 亚洲综合激情五月丁香六月| 91大神福利在线观看| 国产亚洲精品精品精品| 91高清欧美黄色| 亚洲一区二区日本无码| 免费看日韩一级片黄色| 三根一起进出h黄蓉太疼了| 轻轻搞欧美激情| 国产毛片欧美毛片久久久| 国产精品久久久久永久免费看| 欧美三级在线播放线观看| 久久久久久久久九九九| 日本三级欧美三级中文字幕| 日韩免费一级毛片| www黄色免费| 亚洲熟女熟妇天堂老女人| 国产精品久久人妻互换| 日韩电影理论片| 日本亚洲精品无码区国产电影| 日韩不卡在线播放| 涩涩爱夜夜撸撸社区| 在线看av的网站| 国产人妻无码一区二区三区不卡| 亚洲国产av福利| 三a级毛片| 男人天堂2018亚洲男人天堂| 国精品人妻无码一区二区三区软件| 日本无码毛片一区二区手机看| mdapptv麻豆下载| 欧美精品一区二区观看| 亚洲系列中文字幕| 国产欧美VA欧美VA香蕉在| 狠狠综合久久综合88亚洲| 内衣秀无打底露了毛| 日本一区二区三区欧美激情| 97SE亚洲国产综合在线| 欧美韩日一级大片| 免费看少妇高潮A片黄| 国产精品高清视亚洲一区二区|