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深圳市安培生物科技有限公司
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氨甲喋呤抗性和DHFR擴增實驗方法

時間:2021/10/29閱讀:1351
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材料與儀器

中國倉鼠細胞或生長快的人或小鼠細胞系 氨甲蝶呤鈉鹽
0.15mol LNaCl
組織培養瓶 吸管 不含胸苷和次黃(口票)呤的培養瓶 倒置顯微鏡 液氮罐

實驗步驟

1. 克隆培養親代細胞形成生長旺盛、基因型一致的細胞群體,用于篩選。

2. 用無菌 NaCl 0.15 mol/L ( 0.85 % ) 稀釋 MTX,臨床使用的包裝是濃度為 2.5 mg/ml 的溶液。

3. 在幾個相同的培養瓶中分別種 2.5×105 個細胞,每個培養瓶中加入不含 MTX 或含 0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.05 μg/ml 和 0.1 μg/ml MTX 的*培養基,將培養基的 pH 調至 7.4,37°C 培養 5~7 天。

4. 在倒置顯微鏡下觀察細胞,如果培養瓶中出現有一小部分細胞克隆生長,其余的一些細胞是變大的,附著在基質層上的可能要死的細胞,選擇這種培養瓶的細胞,換含有相同量 MTX 的新鮮培養基繼續培養。

5. 如果需要,可以更換新鮮培養基,再培養 5~7 天,但是細胞必須始終處于 MTX 環境中。當細胞密度達到 2~10×106 個/瓶,將細胞以每瓶 2.5×105 個傳入新培養瓶,分別加人原濃度的 MTX 和 2~10 倍原濃度的 MTX 。

6. 5~7 天后觀察新傳代的和原來加入較高濃度 MTX 的細胞,更換培養基,選擇可用細胞,方法同前。

7. 每步傳代的細胞用逐步增高的藥物濃度持續篩選,直至獲得要求的耐藥水平。改變而獲得低到中等水平耐藥、DHFR 活性增加和(或)轉運能力改變的中同倉鼠細胞需要 2~3 個月;對于中國倉鼠細胞、小鼠細胞或生長快的人的細胞來說,獲得高水平耐藥性和酶過度產生的變異株需要 4~6 個月或更長時間。

8. 定期凍存篩選中的細胞于液氮中。


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