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瓊脂糖凝膠電泳、酶和試劑的使用等一些注意事項

時間:2021/8/24閱讀:2133
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基因克隆在發明后的 32 年,需求一直不斷增加,但是有些小伙伴的重組質粒就是怎么樣都構建不出來。其實,看似簡單的傳統基因克隆,可是存在著重重陷阱!美國羅林斯研究中心 (Rollins Research Center)Ichiro Matsumura 在一期的《BioTechniques》上分享了他的經驗: “Why Johnny can’t clone: Common pitfalls and not so common solutions."小編今天就把核心的 “姿勢"給大家提煉出來,主要是瓊脂糖凝膠電泳、酶(DNA 聚合酶、限制性內切酶、T4 連接 酶等)和試劑的使用等一些注意事項。


瓊脂糖凝膠電泳、酶和試劑的使用等一些注意事項

▲從 PCR 產物到質粒的工作流程


1.聚合酶 

DNA 聚合酶有兩個對 PCR 過程不可少的附加屬性,但是不利于后續克隆的步驟。第一, Taq/DNA 混合物的解離常數在室溫中是 20 nM,與擴增產物的終濃度相當,因此酶往往與擴增產物同時純化。實際上,大多數其他商用 DNA 聚合酶與 DNA 結合的更加緊密。殘存的聚合酶可以阻止限制性內切酶作用于 DNA 末端,或者填補突出的部分。第二,市場上一些改造后的新型 DNA 聚合酶相比于 Taq 酶熱穩定性更高,在有機溶劑和離液鹽中的構象穩定性也更高,PCR 產物的純化更加困難了。


2.割膠回收 

載體經過酶切后,需要經過凝膠純化提高克隆效率。割膠回收對技術要求高,也很難自動化, 而且 DNA 暴露在紫外光下會大大降低轉化效率。凝膠純化的產量往往有限,因此研究人員需要消化毫克級的 DNA,才能產生最后的終產物。殘留的瓊脂糖或凝膠提取過程中引入的各種溶劑和鹽,可能抑制后續 T4 連接酶的活性,從而降低克隆效率。另外回收效率還與片段的長短相關,小于 500bp,或者大于 4kb 的片段,加異丙醇有助于提高回收效率。


3.限制性內切酶 

限制性內切酶的出現是為了保護細菌免受噬菌體及其他入侵者。因此,限制性內切酶/DNA 底物的 KM 值相當低(米氏常數 KM 值等于酶促反應速度為最大速度一半時的底物濃度,是酶的特征性常數之一。KM 值只與酶的結構、酶所催化的底物和反應環境如溫度、PH、 離子強度有關,與酶的濃度無關。Km 值愈小,酶與底物的親和力愈大)。所以“提高酶切反 應中 DNA 的濃度,這樣凝膠純化的產物才足夠連接反應使用"是錯誤的!在這種情況下, 限制性內切酶會受到抑制,從而導致不*的消化。


4.T4 連接酶 

連接反應失敗的原因有很多,但失敗可能在加入 T4 DNA 連接酶之前就發生了:由于 DNA 聚合酶擴增不*導致的末端不均一、酶切不*、連接酶抑制劑或者突出的部分被補平。在某些情況下,連接反應失敗可能是因為退火效率不夠、反應緩沖液中的 ATP 濃度過低(室溫孵育時間過長)或者酶可能變性了。T4 連接酶在室溫下相當穩定,但如果被水而不是合適的 buffer 稀釋后可不是如此。如果有問題,可以通過陽性對照來檢測酶的完整性:


瓊脂糖凝膠電泳、酶和試劑的使用等一些注意事項


5.感受態細胞轉化 

在克隆過程中,具有高效轉化效率的感受態細胞至關重要,這對于之前并不高的分子克隆效率具有一定的補償作用。最常見的兩種轉化方法:熱激轉化和電穿孔。電穿孔是*的,更重要的是,轉化細胞的數量與 DNA 的量成正比,可以達到微克級別,且不會出現熱激中 出現的菌株效應或者對質粒的長度有限制,所以對于困難的克隆項目,電穿孔無疑是首先選擇的方法。不過雖然熱激轉化效率不及電穿孔,而且會因 DNA 過量(>10ng/200μl 感受態細胞)而抑制轉化,但是它方便啊!“冰一冰、熱一熱、涼一涼、加一下再搖一搖"就搞定了,所以還是有很多人使用這個方法的!


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