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為什么不能用質(zhì)粒DNA抽提試劑來提取基因組DNA?

時間:2021/8/24閱讀:3480
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導(dǎo)讀

    為什么同樣抽提質(zhì)粒DNA的試劑不能用來抽提基因組DNA呢?差別很大么?要買兩種試劑盒真是麻煩啊!你還不要不相信,有小伙伴試過,還真沒抽提出來。今天小編就來和大家一起探究下原因!


基因組DNA的抽提,一般不會用到質(zhì)粒抽提的試劑盒,究其原因是由于兩者的原理*不同。兩者不都是DNA抽提么?其實(shí)關(guān)鍵在于這兩者在實(shí)驗(yàn)的初始設(shè)計(jì)上就*不同。先給大家解釋一下質(zhì)粒抽提吧。


質(zhì)粒抽提

質(zhì)粒抽提通常用的是堿裂解法,一般的試劑盒都會有 SolutionⅠ,SolutionⅡ,SolutionⅢ,有的還會有 SolutionⅣ,然后是過柱子。


SolutionⅠ

    SolutionⅠ一般都是用來重懸菌液的,會加入RNaseⅠ,降解掉里面大腸桿菌的RNA。同時里面還會用Tris-HEI體系來維持一個pH,另外會加入較大量的EDTA,去螯合掉里面二價(jià)金屬離子,使菌體本身的DNase失活。其實(shí)用雙蒸水來代替SolutionⅠ問題也不大,關(guān)鍵就是把菌重懸起來就行。


Solution Ⅱ

    Solution Ⅱ,一般來說主要成分有兩個,就是NaOH和SDS,NaOH主要是用于破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),強(qiáng)堿條件下,菌體的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的磷脂雙分子層和微囊結(jié)構(gòu)的構(gòu)相都會發(fā)生變化。而SDS在這里主要并不是起到裂解蛋白的作用,而是結(jié)合氨基酸,一般兩個氨基酸可以結(jié)合一個SDS分子。菌體裂解后,其實(shí)小片段的質(zhì)粒已經(jīng)釋放出來了,而大片段的基因組DNA還結(jié)合在蛋白質(zhì)上。


Solution Ⅲ

    Solution Ⅲ的主要成分是醋酸鉀/醋酸緩沖液。首先長時間強(qiáng)堿環(huán)境下,DNA會斷裂,所以需要用醋酸進(jìn)行中和,而鉀離子可以與SDS產(chǎn)生沉淀反應(yīng),使可溶于水的十二烷基磺酸鈉變成不溶于水的十二烷基磺酸鉀。這樣結(jié)合蛋白質(zhì)的PDS就被沉淀下來了,同樣基因組DNA也同樣被沉淀了下來,用硅膠吸附釋放在上清里的質(zhì)粒,或者用無水乙醇對上清進(jìn)行沉淀,即可獲得質(zhì)粒的DNA。


基因組DNA抽提

而普通的基因組 DNA 抽提,首先是裂解,用離子型的蛋白變性劑:CTAB 或者 SDS 對細(xì)胞進(jìn)行裂解(加不加蛋白酶 K 其實(shí)并不太要緊),破膜的同時使得 DNA 從蛋白上解離下來。 加入高鹽溶液使蛋白質(zhì)沉淀。然后用酚仿,使蛋白質(zhì)沉淀變性在水相油相間,并分離出的可溶性蛋白。上清用異丙醇將 DNA 沉淀下來,同時低溫加入一定量的一價(jià)陽離子,可加速 DNA 沉淀。這些能和上述的質(zhì)粒抽提混為一談么?!當(dāng)然不行啊! 


小伙伴們現(xiàn)在能明白為啥基因組 DNA 不能用質(zhì)粒抽提的試劑了吧……




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