PriCells: 正常人原代角膜間質細胞的分離      

實驗材料：
1. 完整的人角膜；
2. GMF-Saline G；
3. 中性蛋白酶Ⅱ；PriCellls原代細胞分離試劑盒
4. L型膠原酶，1mg/ml在DMEM/F12/GASP中；
5. GMF-Saline G配制的TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶；
6. DMEM/F12/GASP；
7. DEME/F12/2FB/GASP：DMEM/F12/GASP含2%FBS；
8. CMF/GASP；
9. 3.5cm塑料組織培養皿或6孔板；
10. 手術刀或單刃的安全刀片；
11. 細胞濾網，70μm血液尼龍過濾網；
12. 塑料刮片，“Cell Lifter"或“Cell Scraper"；
13. 彎虹膜剪，11cm（4-3/8in）；
14. Jeweler’s鑷，10cm（4in）；
15. 角膜剪，19mm刀刃，尖頭；
16. Colibri縫紉鉗，0.1mm；
17. SDS樣本緩沖液，使用終濃度：0.058mol/L Tris，5%丙三醇，1.67% SDS，0.02%溴酚藍；
18. PriCells原代細胞特制基礎培養基；
19. PriCells原代細胞培養特制添加劑；

實驗方法：
1. 用GMF-Saline G清洗角膜3×5min；
2. 剪除殘留的鞏膜，結膜和虹膜；
3. 加入PriCells原代細胞分離試劑盒的試劑，4℃搖床搖動過夜；
4. 將加入試劑的角膜4℃搖30min；
5. 用DMEM/F12/GASP清洗角膜；
6. 解剖顯微鏡下，小心去除上皮和內皮細胞；
7. 用塑料刮片輕刮基膜的上皮細胞面和內皮細胞面。顯微鏡下觀察，以確保*去除這些細胞層；
8. 用新鮮培養基清洗角膜基質一次；
9. 用手術刀或安全刀片或精細手術剪將基質剪碎成2mm左右的小塊；
10. 用DMEM/F12/2FB/GASP配制的膠原酶37℃消化3h，直至大多數組織消失；
11. 400g離心10min，棄上清；
12. 用DMEM/F12/2FB/GASP重懸細胞，用70μm細胞濾網過濾消化液，并離心；
13. 重復上述清洗步驟2遍，每遍之后細胞計數；
14. 用MJM將分離出的間質細胞重懸并以1×10⁴/cm²的密度接種至塑料組織培養皿；
15. 每三天更換一次PriCells原代細胞特制基礎培養基＋PriCells原代細胞培養特制添加劑；
16. 當細胞達90%匯合時用胰蛋白酶消化傳代：