大鼠骨髓間充質干細胞（BMSC）分離自骨髓；骨髓是機體的造血組織，位于身體的許多骨骼內。成年動物的骨髓分兩種：紅骨髓和黃骨髓。紅骨髓能制造紅細胞、血小板和各種白細胞。血小板有止血作用，白細胞能殺滅與抑制各種病原體，包括細菌、病毒等；某些淋巴細胞能制造抗體。因此，骨髓不但是造血器官，它還是重要的免疫器官。骨髓是存在于長骨（如肱骨、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如髂骨）的稀松骨質間的網眼中，是一種海綿狀的組織，能產生血細胞的骨髓略呈紅色，稱為紅骨髓。出生時，紅骨髓充滿全身骨髓腔，隨著年齡增大，脂肪細胞增多，相當部分紅骨髓被黃骨髓取代，最后幾乎只有扁平骨骨髓腔中有紅骨髓。骨髓基質系統內存在的骨髓間充質干細胞是一種除造血干細胞以外的、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，可以向骨、軟骨、肌組織、皮膚、脂肪、神經等多種組織分化，因此可以作為組織工程中的種子細胞。在骨髓中，BMSC占骨髓有核細胞總數的0.001%-0.1%，含量極低。骨髓間充質干細胞的體外培養條件要求較高，在培養過程中，受貼壁時間、種植密度、血清含量、培養溫度和培養基pH值等條件的影響。
一、實驗原理
活細胞在超低溫下克服了分子間的熱運動，因而可長期保存而不影響活力。在不加任何物質條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加人保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍結前透出細胞。儲存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
二、實驗材料
①器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機、-70 ℃低溫冰箱、超凈工作臺等。
②試劑：0.25%胰酶、培養基、凍存液（血清:DMSO=9:1）。
三、操作步驟
①選擇處于對數生長期的細胞，在凍存前24 h內換液。
②用0.25%胰蛋白酶消化細胞，倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。加人與消化液等體積的新鮮培養液。將細胞懸液收集至離心管中。
③1000 r/min離心5 min，棄掉含胰蛋白酶的上清液。
④加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為5×106~1×107個/mL。
⑤將懸液分至凍存管中，每管1mL。
⑥將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現爆裂。
⑦貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。
⑧將裝有細胞的凍存管在4℃下存放30 min，轉放-20 ℃冰箱4 h，然后放入-70 ℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氨容器內(-196 ℃)。
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