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核酸檢測法之核酸隔離采樣工作站
核酸檢測法之核酸隔離采樣工作站
LB-3315型雙人移動式核酸隔離箱
HIV核酸定性檢測
1.1 方法和試劑
1.1.1 方法
(1)檢測方法為商品化試劑盒和實驗室自建方法,商品化試劑應嚴格按說明書操作。下面介紹的方法是實驗室自建方法,供參考。
(2)檢測血漿或血清樣品使用逆轉錄PCR(RT-PCR)方法,建議輪PCR擴增使用RT-PCR一步法;檢測血細胞或組織樣品使用PCR方法。一般使用擴增兩輪的套式PCR方法。
(3)設立陽性、陰性及空白對照。陽性對照為與待測樣品同質、含有目的基因的樣品;陰性對照為與待測樣品同質、不含有目的基因的樣品。陽性和陰性對照樣品應與待檢樣品處理程序一致。陰性對照的設置數量應根據實驗樣品的數量設置在不同的位置。
1.1.2 試劑
(1)PCR引物:一般使用擴增HIVgag和/或pol和/或env和/或LTR等引物。進行RNA逆轉錄時可使用下游特異性引物或隨機引物。引物設計可參考文獻或自行設計,應盡量涵蓋常見的HIV流行毒株,也可使用兼并性引物。
(2)主要試劑:包括核酸提取純化、逆轉錄、PCR所需的試劑。使用商品化核酸提取純化試劑、逆轉錄酶反應試劑和PCR擴增試劑。
(3)抗污染試劑:實驗室自建檢測方法可使用抗污染試劑,參考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。
1.2 擴增目的基因片段
1.2.1 樣品的采集和處理
1.2.2 核酸提取