人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的培養(yǎng)是一項(xiàng)重要的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。下面將詳細(xì)介紹HUVEC的培養(yǎng)步驟，并分享一些經(jīng)驗(yàn)。

1. 準(zhǔn)備工作：

   a. 15-20cm長(zhǎng)的新生兒臍帶放入無(wú)菌的PBS溶液中儲(chǔ)存。

   b. 注意臍帶最多貯存24小時(shí)在4℃下，室溫下不超過(guò)6小時(shí)。

2. 洗滌臍帶：

   a. 使用一個(gè)鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無(wú)菌的PBS溶液沖洗3-5次，直至污血沖洗干凈。

3. 消化臍帶：

   a. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入15ml的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化15-20分鐘，并不時(shí)上下?lián)u動(dòng)臍帶。

4. 收集消化液：

   a. 消化完后，將下端手術(shù)鉗松開(kāi)，消化液流入一個(gè)50ml無(wú)菌離心管中，用無(wú)菌的PBS溶液沖洗臍帶2-3次。

5. 離心：

   a. 將收集液離心（2000轉(zhuǎn)/分）3分鐘。

6. 轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中：

   a. 倒去上清，加入10ml M199培養(yǎng)基（加入10U/ml的bFGF），用彎管吹散細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個(gè)用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。

   b. 在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入3-4ml無(wú)菌的1%明膠溶液，搖勻使得明膠溶液鋪滿(mǎn)瓶底，放入37℃孵育，最少2小時(shí)，用前將明膠溶液倒掉即可。明膠包被有利于細(xì)胞貼壁。

7. 培養(yǎng)細(xì)胞：

   a. 培養(yǎng)24小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，并用無(wú)菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入10ml新鮮的M199培養(yǎng)基。

8. 換培養(yǎng)基：

   a. 以后每2天換一次培養(yǎng)基（每次換掉2/3的培養(yǎng)基）。

9. 細(xì)胞生長(zhǎng)：

   a. 一般培養(yǎng)5-7天，細(xì)胞可長(zhǎng)滿(mǎn)至80-90%單層，這時(shí)可以進(jìn)行傳代。

10. 傳代：

    a. 倒掉培養(yǎng)基，用無(wú)菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀(guān)察，一旦細(xì)胞變圓，即加入2-3倍有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

    b. 用彎管將細(xì)胞吹打下來(lái)，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml無(wú)菌離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘。

    c. 倒掉上清，加入10ml新鮮培基，一般一瓶細(xì)胞可傳代3-4瓶。以后照此傳代培養(yǎng)。

11. 優(yōu)化培養(yǎng)：

    a. 一般傳代2-3代（培養(yǎng)了20天左右）用于各種實(shí)驗(yàn)效果較好。

以上是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的培養(yǎng)步驟，希望對(duì)你有所幫助。