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real-time PCR

熒光定量PCR實驗步驟：

1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經(jīng)過濕熱滅菌，無RNA酶）

1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預冷。

2）取100mg組織，加入到勻漿器中。

3）充分研磨直至無可見組織塊。

4）13000g離心10min取上清。

5）加入250 μl，顛倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。

6）4℃下13000g離心8min。

7）將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。

8）-20℃放置15min。

9）4℃下13000g離心10min，管底的白色沉淀即為RNA。

10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。

11）4℃下13000g離心5min。

12）將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3min。

13）加入20μl無RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃孵育5min。

2、反轉(zhuǎn)錄（槍頭和PCR均經(jīng)過濕熱滅菌，無RNA酶）

1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl oligo(dT)15。

3）用無核糖核酸酶的去離子水補足至12μl。

4）于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻。

5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻。

6）于PCR儀上42℃保溫60min，結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

3、定量PCR1）取0.2ml PCR管，配制如下反應體系，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。2× qPCR Mix 12.5μl7.5μM基因引物 2.0μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μlddH2O 8.0μl2）取0.2ml PCR管，配制如下反應體系，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。2×qPCR Mix 12.5μl7.5μM內(nèi)參引物 2.0μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μlddH2O 8.0μl3）PCR擴增預變性 95℃，10min循環(huán)（40次） 95℃，15s→60℃，60s溶解曲線 75℃→95℃，每20s升溫1℃4、結(jié)果處理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測樣本)- CT(內(nèi)標基因，待測樣本)B=CT(目的基因，對照樣本)- CT(內(nèi)標基因，對照樣本)K=A-B表達倍數(shù)=2-K

real-time PCR