要成功地執行 Duolink® PLA 實驗，實驗方案中有一些必要的考慮因素需要正確地準備、設置和執行。Duolink® PLA 產品可用于熒光和明場。熒光 Duolink® PLA 試劑可用于顯微鏡和流式細胞術應用。
一、實驗設計
要設計一個成功的Duolink® PLA實驗，必須考慮很多因素。這些因素包括但不限于：
1.確定蛋白質靶標和實驗類型
2.選擇樣品（細胞或組織）
3.設計您的讀出方案
4.設計實驗對照（技術和生物）
靶標識別：
首先要確定的是目標蛋白靶標。是單一蛋白質表達，蛋白質與蛋白質的相互作用 (PPI)，還是蛋白質翻譯后修飾 (PTM)？下面簡要介紹了 Duolink® PLA 如何用于檢測各種類型的蛋白靶點。
單一蛋白表達的檢測：
檢測單個蛋白靶標有兩種方法，即使用針對靶標的一種一抗進行單一識別或兩種一抗進行雙重識別。
單一識別：
具有最高的靈敏度，建議在檢測低表達水平的單一蛋白質靶標時使用。也可用于雙重識別實驗前對單個一抗濃度的測定。但是，只有當性能良好的特異性一抗可用時，才推薦使用此方法。由于測定的敏感性，使用非特異性一抗將導致高背景。
雙重識別：
通過使用兩種一抗提供了更高的特異性。每種一抗必須針對同一靶分子上不同的、非競爭性的表位。而且，這兩種一抗必須在不同物種（小鼠、兔或山羊）中培養，并且必須在相同的實驗條件下與靶標結合。這些條件在下面的實驗準備部分中進行了描述。
蛋白質與蛋白質的相互作用檢測：
Duolink® PLA是檢測蛋白質相互作用的方法。該方法使用兩種一抗來完成，每種抗體針對一種目標靶標，且在不同物種（小鼠、兔或山羊）中培養。兩種一抗必須在相同的實驗條件下與靶標結合。
蛋白質與核酸的相互作用檢測：
蛋白質-DNA 和蛋白質-RNA 相互作用也可以通過使用修飾的原位雜交技術結合Duolink® PLA來進行檢測。
二、實驗準備
為確保成功執行 Duolink® PLA 實驗，需要進行大量準備工作。這些準備工作與傳統的 IF、IHC 或流式細胞術所需的工作類似。本節描述了一抗鑒定、樣品制備和抗體優化的注意事項。
一抗的選擇：
Duolink® PLA試劑是使用二抗進行靶標特異性一抗檢測的通用試劑。設置 Duolink® PLA 實驗時，一抗的選擇至關重要。
要求：
Duolink® PLA探針是驢抗小鼠、抗兔或抗山羊二抗；因此，對一抗有特定要求。這包括：
1.IgG 類
2.可以是單克隆或多克隆
3.優選親和純化以使交叉反應性最小化
4.建議使用 IF 或 IHC 驗證
5.宿主必須是小鼠、兔子或山羊（特例情況要求使用Duolink® Probemaker）
直接偶聯一抗的使用：
有些情況下需要使用直接偶聯的一抗。Duolink® Probemaker能夠將 PLA oligo (PLUS 或 MINUS) 偶聯到任何抗體上。使用 Duolink® Probemaker 的注意事項如下：
1.當一抗的宿主不是小鼠、兔或山羊時
2.當使用來自同一物種的兩種一抗時
3.當使用在與組織樣品相同的宿主中產生的一抗時（例如，“小鼠一抗檢測小鼠樣品"）
一抗優化：
為了成功執行 Duolink® PLA 實驗，確定待測樣品中最佳一抗性能的條件非常重要。一抗優化的條件應包括：
1.樣品處理（固定、透化和抗原修復）
2.一抗濃度
3.阻斷溶液和抗體稀釋劑
下面介紹樣品處理、阻斷和抗體稀釋劑的具體注意事項。強烈建議首先通過 IF 或 IHC 染色鑒定一抗的條件。當使用兩種一抗時，每種一抗的優化應分開進行，但樣品處理需要兼容兩種一抗的最佳性能。
一旦 通過IF 或 IHC 確定了條件，這些條件就可以應用于 Duolink® PLA。但是，Duolink® PLA 實驗可能需要進一步滴定一抗濃度，因為與 IF 和 IHC 相比，Duolink® PLA 具有更高的靈敏度和更放大的信號。使用上述Duolink® PLA單一識別方法可在優化一抗濃度時提供最高的靈敏度。這些條件可用于使用兩種一抗的 Duolink® PLA 實驗。
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