在開發(fā)特定細(xì)胞系的培養(yǎng)條件時(shí)需要考慮許多參數(shù)。我們都知道 pH 平衡、氧氣水平和血清濃度是影響培養(yǎng)成敗的重要變量。然而，包括與細(xì)胞需求相匹配的解離方法的傳代方案也同樣重要。考慮到這一點(diǎn)，我們將回顧一些常見解離實(shí)踐背后的原則，以幫助您根據(jù)細(xì)胞系的具體性質(zhì)定制方法。
懸浮生長的細(xì)胞易于傳代培養(yǎng)。只要在細(xì)胞耗盡營養(yǎng)供應(yīng)之前將細(xì)胞稀釋到合適的新鮮培養(yǎng)基中，它們就會(huì)表現(xiàn)得很好。另一方面，單層生長的細(xì)胞彼此之間以及與培養(yǎng)皿之間形成蛋白質(zhì)接觸。在將細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中、離心并重新鋪板之前，必須先將這些物質(zhì)破壞。因此，必須特別考慮以確保解離條件破壞細(xì)胞接觸而不殺死細(xì)胞。
在決定解離條件時(shí)，研究者應(yīng)考慮細(xì)胞形成的鍵的類型。一些貼壁細(xì)胞系僅形成微弱的接觸，只需將培養(yǎng)瓶敲擊手掌或?qū)⑴囵B(yǎng)瓶敲擊臺(tái)面即可破壞接觸。其他貼壁細(xì)胞系，特別是那些源自上皮的細(xì)胞系，會(huì)形成牢固的多蛋白緊密連接，只能通過酶消化來破壞；在這些情況下，通常使用胰蛋白酶（一種絲氨酸蛋白酶）。源自上皮的細(xì)胞還可以表達(dá)鈣粘蛋白，其介導(dǎo)非常強(qiáng)的鈣依賴性粘附或橋粒連接。在這種情況下，可能需要添加鈣螯合劑（如 EDTA）來隔離鈣，以有效地解離細(xì)胞。
為了優(yōu)化解離后的細(xì)胞活力，反應(yīng)條件應(yīng)與細(xì)胞接觸的強(qiáng)度相匹配。例如，如果標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶/EDTA 消化（通常為 0.05%-0.5%）不能有效消化細(xì)胞鍵（10-15 分鐘內(nèi)），則可能很難在細(xì)胞開始死亡之前將其從平板上移除，并且細(xì)胞活力也會(huì)受到影響。將會(huì)受到不利影響。在這種情況下，可能需要更高濃度的胰蛋白酶/EDTA 或其他酶，例如膠原酶。另一方面，如果反應(yīng)過于劇烈，細(xì)胞可能會(huì)裂解或失去重新附著到平板上所需的表面蛋白，這兩種情況都會(huì)導(dǎo)致活力降低。此外，裂解的細(xì)胞會(huì)釋放基因組 DNA，導(dǎo)致活細(xì)胞聚集，使存活細(xì)胞更難重新鋪板，因此需要添加 DNase。
如果您已將反應(yīng)強(qiáng)度與細(xì)胞系的粘附特性相匹配，但您的細(xì)胞仍然難以去除，您可能會(huì)發(fā)現(xiàn)問題在于細(xì)胞準(zhǔn)備解離的方式。生長培養(yǎng)基中可能存在抑制胰蛋白酶的成分，例如血清，但這可以通過簡單地用Dulbecco PBS沖洗細(xì)胞一到兩次來克服 （不含鈣或鎂）在添加解離試劑之前。也可能是細(xì)胞保持匯合的時(shí)間太長。在這些條件下，細(xì)胞可能會(huì)形成異常牢固的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-表面連接，并且異常難以破壞。出于這個(gè)原因，以及為了培養(yǎng)物的整體健康，建議細(xì)胞在達(dá)到 100% 匯合（即 70-90% 匯合）之前進(jìn)行傳代。
有了對(duì)解離試劑如何工作的基本了解，研究人員可以開發(fā)一種優(yōu)化的方案，同時(shí)考慮細(xì)胞粘附特性的強(qiáng)度和質(zhì)量。細(xì)胞解離的優(yōu)化方案將確保成功傳代并延長細(xì)胞在培養(yǎng)物中的壽命。
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