標(biāo)準(zhǔn)曲線較差
原因 | 解決方案 |
標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置有誤 | 確認(rèn)是否進(jìn)行正確稀釋。 |
標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶不當(dāng) | 開蓋前進(jìn)行離心；檢查復(fù)溶后是否存在不溶物。 |
標(biāo)準(zhǔn)品已降解 | 按推薦方式保存和處理標(biāo)準(zhǔn)品。 |
曲線的標(biāo)度不適合 | 嘗試使用不同標(biāo)度繪制曲線，例如雙對(duì)數(shù)、5 參數(shù)擬合。 |
移液器加樣誤差 | 正確使用經(jīng)過校準(zhǔn)的移液器 |
原因 | 解決方案 |
孵育時(shí)間過短 | 樣品在 4 ℃ 孵育過夜，或遵循試劑的實(shí)驗(yàn)方案。 |
靶標(biāo)含量低于檢測(cè)范圍 | 減小樣品的稀釋倍數(shù)或濃縮樣品。 |
樣品類型不適用 | 對(duì)于沒有驗(yàn)證過的樣品類型，檢測(cè)信號(hào)可能減弱或沒有使用驗(yàn)證過的樣品類型作為陽性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。 |
抗原表位被孔板吸附，無法識(shí)別 | 使用直接或間接 ELISA 方法增強(qiáng)檢測(cè)肽的能力，將肽偶聯(lián)到大的載體蛋白上，然后包被到微量滴定板。 |
檢測(cè)緩沖液的相容性 | 確保檢測(cè)緩沖液與靶標(biāo)兼容（例如，保留酶活性、保留蛋白質(zhì)相互作用）。 |
檢測(cè)試劑不足 | 遵循試劑的實(shí)驗(yàn)方案，增加檢測(cè)試劑的濃度或用量。 |
樣品制備不正確 | 確保進(jìn)行正確的樣品制備/稀釋。樣品可能與微量滴定板測(cè)定形式不兼容。 |
抗體不足 | 嘗試不同的抗體濃度/稀釋。 |
孵育溫度過低 | 確保在正確溫度下進(jìn)行孵育。所有試劑（包括孔板）在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前應(yīng)處于室溫，或試劑的實(shí)驗(yàn)方案所建議的溫度。 |
波長(zhǎng)不正確 | 確認(rèn)波長(zhǎng)，再次讀板。 |
孔板被強(qiáng)力洗滌 | 檢查并確保自動(dòng)洗滌系統(tǒng)的壓力正確。如果手動(dòng)洗滌，則輕輕吸取沖洗緩沖液。 |
孔變干 | 測(cè)定開始后，不要讓孔變干。將所有的孵育步驟使用封口膜或膠帶密封孔板。 |
酶反應(yīng)的顯色速度慢 | 使用前配制底物溶液。確保母液未過期、未污染。延長(zhǎng)孵育時(shí)間。 |
原因 | 解決方案 |
孔中有氣泡 | 讀板前，確保不存在氣泡。 |
孔洗滌不均/未充分洗滌 | 檢查洗板機(jī)的所有管口是否暢通。使用推薦方法進(jìn)行洗滌。 |
試劑混勻不充分 | 確保所有試劑充分混勻。 |
移液量不一致 | 正確使用經(jīng)過校準(zhǔn)的移液器 |
邊緣效應(yīng) | 確保孔板和所有試劑處于室溫。 |
樣品制備或保存條件不一致 | 確保樣品制備保持一致，使用合適樣品保存條件（例如盡可能減少反復(fù)凍融）。 |
原因 | 解決方案 |
孔洗滌不充分 | 按照實(shí)驗(yàn)方案建議進(jìn)行洗滌。 |
洗滌緩沖液污染 | 制備新鮮的洗滌緩沖液。 |
檢測(cè)試劑過多 | 確保試劑被正確稀釋或者減少檢測(cè)試劑的推薦濃度。 |
封閉緩沖液無效（例如檢測(cè)試劑結(jié)合封閉劑；孔未封閉） | 嘗試不同的封閉劑和/或?qū)⒎忾]劑添加到洗滌緩沖液。 |
孵育/洗滌緩沖液的鹽濃度 | 增加鹽濃度可能會(huì)降低非特異性和/或減弱脫靶相互作用。 |
讀板前加入終止液后時(shí)間太長(zhǎng) | 添加終止液后立即讀板。 |
抗體出現(xiàn)非特異性結(jié)合 | 使用適當(dāng)?shù)姆忾]緩沖液，例如 BSA 或 5-10% 正常血清，如果是直標(biāo)一抗，使用與一抗種屬相同的血清，如果是非直標(biāo)一抗，則使用與二抗種屬相同的血清。確保孔已經(jīng)過預(yù)處理，以防止非特異性附著。 |
高抗體濃度 | 嘗試不同的稀釋度，以獲得好的結(jié)果。 |
底物孵育在光下進(jìn)行 | 底物孵育應(yīng)避光進(jìn)行，或根據(jù)試劑的實(shí)驗(yàn)方案建議進(jìn)行。 |
底物加入后孔中有沉淀生成 | 增大樣品的稀釋倍數(shù)或降低底物濃度。 |
孔板臟 | 清潔孔板底部。 |
原因 | 解決方案 |
ELISA 試劑盒保存不當(dāng) | 按推薦方式保存所有試劑。請(qǐng)注意，各試劑的保存條件可能有所不同。 |
靶標(biāo)不足 | 濃縮樣品或降低樣品稀釋度。 |
檢測(cè)試劑失活 | 確保報(bào)告酶/熒光素具有預(yù)期的活性。 |
酶標(biāo)儀設(shè)置不正確 | 在檢測(cè)中，確保酶標(biāo)儀設(shè)置為正確的吸收波長(zhǎng)或激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)。 |
測(cè)定方法不夠靈敏 | 更換更靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)（例如從比色檢測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)發(fā)光/熒光檢測(cè)）。更換更靈敏的測(cè)定方法（例如從直接 ELISA 方法轉(zhuǎn)變?yōu)閵A心 ELISA 方法）。延長(zhǎng)孵育時(shí)間或升高溫度。 |
微量滴定板吸附靶標(biāo)的效果不佳 | 將靶標(biāo)共價(jià)結(jié)合到微量滴定板。 |
底物不足 | 加入更多底物。 |
樣品類型不兼容（例如血清與細(xì)胞提取物） | 對(duì)于沒有驗(yàn)證過的樣品種屬，檢測(cè)信號(hào)可能減弱或沒有。使用驗(yàn)證過的樣品類型作為陽性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。 |
緩沖液或樣品成分干擾 | 確認(rèn)試劑中是否存在干擾性化合物。例如，抗體中的die氮化鈉會(huì)抑制 HRP 酶，在血漿中用作抗凝劑的 EDTA 會(huì)抑制酶反應(yīng)。 |
混合或混用不同試劑盒的試劑 | 避免混合來自不同試劑盒的試劑。 |
基質(zhì)效應(yīng)
在使用 ELISA方法對(duì)血漿和血清進(jìn)行定量時(shí)，偶爾會(huì)遇到基質(zhì)效應(yīng)所造成的問題。基質(zhì)效應(yīng)可能由多種基質(zhì)組分引起，包括但不限于：內(nèi)源性生物成分之間的相互作用，例如磷脂、碳水化合物和內(nèi)源性代謝物（膽紅素），或目標(biāo)分析物與基質(zhì)之間的相互作用，例如共價(jià)結(jié)合到血漿蛋白。這會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的樣品讀值。
只需將樣品稀釋 2 至 5 倍即可降低基質(zhì)效應(yīng)。稀釋樣品時(shí)，注意應(yīng)使用與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的稀釋劑。
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