實驗干貨——PCR試劑盒注意事項與原則

　　PCR試劑盒注意事項：

　　①加入試劑的順序，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

　　②使用干凈的塑料容器配置洗滌液。

　　③按照雞血紅蛋白(HB)ELISA檢測試劑盒說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

　　④底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

　　⑤洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

　　⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器 。

　　⑦實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

　　⑧試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

　　⑨不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

　　PCR試劑盒原則：

　　①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

　　②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

　　③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

　　⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

　　⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

　　⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。

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