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液相色譜柱

閱讀:1086        發布時間:2019-11-5

液相色譜儀由高壓液體泵分離系統、檢測器及液相色譜柱(含柱溫控制系統)等三部分組成。其中液相色譜柱是液相色譜工作的關鍵,液相色譜柱的性能直接關系到分離分析的準確性與適用性。
液相色譜柱的分類方法很多,可按鍵合相類型、用途(分析型與制備型)、基質種類等進行分類。

例如:
A:物理因素
1.硅膠純度 ----- 填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度
2.色譜柱尺寸---填料床的長度和內徑
3.顆粒形狀------球型或不規則型
4. 粒徑-----------平均顆粒直徑,通常3-10μm
5.表面積---------顆粒外表面和孔表面的總和,以m2/gram表示
6.孔徑------------顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300Å;
B:化學性
1.鍵合類型----- 單體鍵合 - 鍵合相分子與基體單點相連
2.碳覆蓋率------與基體物質相連的鍵合相的量
3.封端------------鍵合步驟之后, 用短鏈將的硅羥基鍵合后封閉起來


影響因素
1 、硅膠基質柱(4大類)
目前,分析型液相色譜柱多為硅膠基質柱,細分為:
高純硅膠柱:以硅烷化硅膠(Silica)為填料,應用范圍較廣,但只能在PH2.0-7.5,小于60度的條件下使用。又由于強性硅羥基(Si-OH)的次保留效應較強,所以應用受到局限,已被鍵合相柱所取代。
反相硅膠柱:是以硅烷化硅膠為基質,表面鍵合弱性官能團的固定相。目前多用C18(ODS)、C8(MOS)、C6H5(phenyl,苯基)等。用于分離大多數有機化合物,應用范圍比較寬
正相硅膠柱:是以硅烷化硅膠為基質,表面鍵合性官能團的固定相。目前較多的為:NH2—(氨基)、CN—(氰基)、DIOL(二羥基,也常做HILIC單獨分類列出,多用于分離有機酸、蛋白質等)。多用于分離光學異構體和反相柱子不能分離的性比較大的物質。
離子交換柱:是以硅烷化硅膠為基質,以磺化交聯鍵合強陽/陰離子基團(磺酸鹽/季銨堿)的固定相,又分為強酸性、強堿性、弱酸性、弱堿性等不同規格。用于分離解離性較強的有機鹽類化合物。(注意:不要同離子色譜混淆,離子色譜主要是分離無機鹽類化合物或某些帶點離子。)
 
2、聚合物基質柱
聚合物基質柱是指采用聚苯乙烯—二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝膠作為主要填料的一類色譜柱。其相對于硅膠柱具有強的疏水性及寬泛的pH范圍(1.0~14.0),但柱效較低,目前主要應用于凝膠滲透色譜(GPC)、凝膠過濾色譜(GFC)及分子排阻色譜(MEC)。主要用于分離蛋白質類等大分子化合物。
 
3、其他無機物填料柱
這類色譜柱只于特用途,主要有石墨化碳、氧化鋁(Al2O3)、氧化鋯(ZrO2)等填料。不需要進行表面改性,其自身表面對多類化合物有強保留。可在任意pH(氧化鋁除外,不能大于12.0)及高溫度(可達100℃)下使用。其中,石墨化碳填料柱能分離多種化合物,主要用于分離幾何異構體;氧化鋁柱剛,柱床穩定,可分離多種化合物且多用于制備色譜;氧化鋯柱較氧化鋁柱有強的pH適用范圍及能耐受高的溫度,但其應用尚待進一步研究。

在選擇色譜柱之前,先多了解自己的樣品和雜質,他們的類型結構、性、酸堿性、分子量大小等等。
1.樣品是性的且弱酸性的;就可以選擇C18在100酸性水溶液條件下檢測,即要選擇承受100純水且對性化合物保留的色譜柱
2. 如果樣品性太強,或酸性太強;可以選擇CN,NH2,或硅膠柱,HILIC(水色譜),也有使用C18+強陰離子對試劑或強陰離子交換色譜柱(缺點是離子對試劑平衡時間長,對流動相pH要求比較精密,否 則很難重復實驗,另外離子對試劑很難洗下來,基本上用了離子對的色譜柱就用于其它實驗)
3. 若樣品是堿性的;可選擇高純硅膠柱(高純硅膠缺少金屬雜質,且硅膠端基封尾)或一些經過修飾的C18柱(如性嵌入技術或堿去活技術等),他們都會減少堿性化合物的拖尾,一般會選擇中性或偏堿的條件下做,因為這樣可增加堿性樣品的保留
4.如果堿性化合物的性太強,或堿性太強;可以選擇寬pH的C18色譜柱在高pH值檢測(優點是方法開發簡單,缺點是目前實現這一技術的色譜柱品牌比較少,價格也高)或者選用HILIC色譜柱(硅膠柱在反相條件下使用,這也是很經典的檢測堿性樣品的方法)選擇強離子交換柱(缺點 是不能用來分析其它樣品,對流動相pH要求比較精密,否則很難重復實驗)也有使用C18+強陰離子對試劑或強陰離子交換色譜柱

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