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五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒（PCR法）說明書
五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒（PCR法）說明書
u 產(chǎn)品說明
五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒PCR法可針對食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進行擴增，儀器實時監(jiān)測擴增過程中的熒光信號變化，自動判讀結(jié)果。本產(chǎn)品用于致瀉大腸埃希氏菌的檢測。檢出限為 103 CFU/ml。
◆ 產(chǎn)品組成（96 測試）
◆ 所需儀器
ABI ，BioRad，TaKaRa 等 PCR 擴增儀，電泳儀，凝膠成像儀等電泳配套設(shè)備。（使用熒光定量 PCR 儀進行定性判讀時則無需電泳設(shè)備）
◆ 自備耗材和儀器
①滅菌 1.5mL 或 2.0mL 離心管；②冰盒；③移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④ 離心機；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴。
◆ 樣品處理
參照《GB4789.6—2016 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》中的操作步驟進行前增菌。建議使用試劑配套細菌基因組 DNA 提取系列產(chǎn)品。
◆ 實驗操作
1.試劑配制（試劑配制區(qū)，放置于冰盒中進行）取出各管試劑，將試劑*解凍，離心 30s。取 12×(所待檢樣品數(shù)+3)的 PCR 反應(yīng)管，按 12 個一組排列并編號，依次向各管中加入 23μL 的 12 種反應(yīng)液。
2.添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進行）向每管反應(yīng)液中分別加入 2μL 模板（或直接使用無菌吸頭挑取少許待檢菌落至反應(yīng)管中）。加樣示例：（有 N 個待測樣品）
取(N+3)組 12 個一組的反應(yīng)管，按順序第一組 12 管中全部加入 2μL 的 NG-DW，第二組 12管中全部加入 2μL的 NG-Ecoli，第三組 12 管中全部加入 2μL 的樣品 1 模板，第四組 12 管中全部加入 2μL 的樣品 2 模板，…，最后組 12 管中全部加入 2μL 的PG-Ecoli。
蓋好 PCR 管蓋后，渦旋混勻 30s，離心 1min，立即進行 PCR 擴增反應(yīng)。
3.擴增反應(yīng)（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）
按下列條件設(shè)置擴增反應(yīng)：（如需使用熒光法進行檢測請選擇 FAM 通道）
PCR 循環(huán) | 熒光收集位點 | ||
37℃ | 10 分鐘 | 1 個循環(huán) | — |
95℃ | 10 分鐘 | 1 個循環(huán) | — |
95℃ | 30 秒 | 30 個循環(huán) | — |
63 ℃ | 30 秒 | — | |
72℃ | 90 秒 | ※ | |
72℃ | 5 分鐘 | 1 個循環(huán) | — |
4.產(chǎn)物電泳（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）
稱量 4. 0g 瓊脂糖粉，加入至 200 mL 的 1×TAE 電泳緩沖液中，充分混勻。使用微波爐反復(fù)加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉*融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至 60℃右時，加入溴化乙錠( EB )至終濃度為 0.5μg/mL， 充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠長度要大于 10cm，厚度宜為 3mm~5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。當(dāng)瓊脂糖凝膠*凝結(jié)硬化后,輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔放置在陰。向電泳槽中加入 1×TAE 電泳緩沖液，液面高于膠面 1mm~2mm。將5μL PCR 產(chǎn)物與 1μL 6×上樣緩沖液混勻后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔，小心上樣于孔中；陽性對照的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物加入到最后一個泳道;第一個泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通電泳儀電源，根據(jù)公式： 電壓=電泳槽正負極間的距離（cm）×5V/cm 計算并設(shè)定電泳儀電壓數(shù)值；啟動電壓開關(guān)，電泳開始以正負極鉑金絲出現(xiàn)氣泡為準。電泳 30min~45min 后，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察結(jié)果，拍照并記錄數(shù)據(jù)。
u 可使用 Gold view、Gal-Rad 等等效的核酸熒光染料替代 EB。
u 推薦使用 DNA Marker：DL2000 或 100bp ladder，等可指示 100bp~1500bp 條帶的 Marker。
◆ 結(jié)果分析
1.陰陽性判讀：
進行電泳檢測時，需對比 Marker 進行判斷，當(dāng)目的靶標對應(yīng)位置出現(xiàn)單一顯著條帶時可判斷該靶標為陽性； 否則為該靶標檢測為陰性。（使用熒光定量 PCR 儀檢測時，檢測孔Ct≤30 時判斷該孔為陽性；當(dāng)檢測孔Ct＞30 時， 該檢測孔為陰性）
示例電泳圖
2.有效性判讀：
需同時滿足：1.空白對照中所有泳道均為陰性；2.陰性對照中 uidA 泳道陽性，其余泳道陰性；2.陽性對照中所有泳道陽性，此時可判斷實驗有效。如無法滿足上述條件，則實驗無效，需重復(fù)實驗；如重復(fù)后結(jié)果仍為無效，請于本公司技術(shù)支持聯(lián)系。
3.結(jié)果判讀：
在實驗有效的情況下，可根據(jù)下表進行判讀：
致瀉大腸埃希氏菌類別 | 目標條帶的種類組合 | |
EIEC | ipaH（＋） | uidA （＋／－） |
EAEC | aggR，astA，pic 中一條或一條以上陽性 | |
EPEC | bfpB（＋／－），eae（＋），stx1（－）stx2，（－） | |
STEC/EHEC | stx1，stx2 中一條或一條以上陽性，eae（＋／－），bfpB（－） | |
ETEC | lt，stp，sth 中一條或以上陽性 | |
u 97%以上大腸埃希氏菌為 uidA 陽性，可參考陰性對照中該基因檢測結(jié)果判斷擴增效果；
u 當(dāng)結(jié)果判定為EPEC 陽性時，若 bfpB 靶標為陽性則說明樣品含有典型EPEC；若 bfpB 靶標為陰性則說明樣品為非典型EPEC；
當(dāng)結(jié)果判定為STEC/EHEC 陽性時，若 eae 靶標為陽性則說明樣品含有典型EHEC；若 eae 靶標為陰性則說明樣品為非典型EHEC。