禽流感病毒H9N2亞型檢測試劑盒

注：陰性對照為禽類動物基因組DNA，陽性對照為失去活性的AIV-H9N2病毒cDNA。

【禽流感病毒H9N2亞型檢測試劑盒儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融,有效期12個月。

【禽流感病毒H9N2亞型檢測試劑盒適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【禽流感病毒H9N2亞型檢測試劑盒 樣本要求】

1.樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：

咽喉拭子，采取時要將拭子深入喉頭及上顎裂來回刮3次～5次，取咽喉分泌液；將咽喉拭子放人盛有1.0 mL生理鹽水的離心管中備用，應避免標本間交叉污染。

2.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃，避免反復凍融。

【禽流感病毒H9N2亞型檢測試劑盒 檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)

（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

    在上述制備好的PCR反應管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

    根據(jù)需要，在上述準備好的PCR反應管中分別加入陰性對照品以及陽性對照品各5 μl，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的檢出*可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的檢出限為10² Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。

注：陰性對照為禽類動物基因組DNA，陽性對照為失去活性的AIV-H9N2病毒cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融,有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：

咽喉拭子，采取時要將拭子深入喉頭及上顎裂來回刮3次～5次，取咽喉分泌液；將咽喉拭子放人盛有1.0 mL生理鹽水的離心管中備用，應避免標本間交叉污染。

2.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃，避免反復凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)

（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

    在上述制備好的PCR反應管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

    根據(jù)需要，在上述準備好的PCR反應管中分別加入陰性對照品以及陽性對照品各5 μl，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的檢出*可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的檢出限為10² Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。