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RT-PCR實驗反應體系靈敏度提升方法匯總
閱讀：1056 發布時間：2023-10-8增加反應體系的靈敏度：
1. 分離高質量RNA：
成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍/酸性酚的一步法。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10,000×g離心5分鐘。
2. 使用無RNaseH活性(RNaseH-)的逆轉錄酶：
在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。
逆轉錄酶催化RNA轉化成cDNA。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。
SuperScriptⅡ逆轉錄酶，RNaseH- 的MMLV逆轉錄酶及thermoScript逆轉錄酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全長的cDNA。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。ThermoScript比AMV的靈敏性強得多。RT-PCR產物的大小受限于逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。同MMLV相比，SuperScripⅡ顯著提高了長 RT-PCR產物的產量。RNaseH- 的逆轉錄酶同時增加了熱穩定性，所以反應可以在高于正常的37-42℃的溫度下進行。在建議的合成條件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的 [α-P]dCTP。第一鏈的總產量使用TCA沉淀法計算。全長cDNA使用在堿性瓊脂糖膠上將大小分類的條帶切除并計數的方法分析。
3. 提高逆轉錄保溫溫度：
較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。對于多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性后也是如此。對這些困難模板的擴增可以使用 ThermoScript逆轉錄酶，并將逆轉錄反應置于較高溫度下進行以改善擴增。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物(GSP)進行cDNA合成時(見第三章)。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。不要在高于60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，并加入預熱的2×的反應混合物提高特異性(cDNA熱啟動合成)。這種方法有助于防止較低溫度時所發生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化 RT-PCR所需的多種溫度切換。
Tth熱穩定聚合酶在Mg2+存在條件下作為DNA聚合酶，在Mn2+存在條件下作為RNA聚合酶。它可以在最高65℃條件下保溫。然而，PCR過程中Mn2+的存在會降低忠實性，這使得Tth 聚合酶不太適合用于高精確度的擴增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆轉錄效率較低，這會降低靈敏度，而且，既然單個酶就可以進行逆轉錄和PCR，那么沒有逆轉錄的對照反應就不能用來將cDNA的擴增產物同污染的基因組DNA的擴增產物區分開來。
4. 促進逆轉錄的添加劑：
包括甘油和DMSO在內的添加劑加到第一鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩定并解開RNA二級結構，最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。為了在SuperScriptⅡ逆轉錄反應中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉錄反應產物加入到PCR中，那甘油在擴增反應中的濃度為0.4%，這不足以抑制PCR。
5. RNaseH處理：
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板，據認為cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產生的信號。對于多數RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。
6. 小量RNA檢測方法的提高：
當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對于小于50mg的組織或106個培養細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。
在使用SuperScriptⅡ的逆轉錄反應中加入乙酰化BSA可以增加靈敏度，而且對于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加入40單位的 RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進行逆轉錄反應時加入 BSA或RNase抑制劑。