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解決PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)假陰性或無擴(kuò)增產(chǎn)物（即陽性對(duì)照中有條帶，而樣品則無條帶）方法：

　　1、條帶放置時(shí)間過久,核酸被降解，最好在48h內(nèi)進(jìn)行電泳檢測(cè)。

　　2、DNA模板純度低，如含有雜蛋白質(zhì)或Taq酶抑制劑，可對(duì)DNA進(jìn)行再次純化或重新用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取DNA; DNA濃度太低時(shí)，可以加大模板量；對(duì)具有二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA使用較好的聚合酶；提取DNA時(shí)，避免吸入酚類試劑。

　　3、對(duì)設(shè)計(jì)不合理的引物進(jìn)行重新設(shè)計(jì)合成；引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融而降解失效；檢測(cè)引物OD值并進(jìn)行電泳檢測(cè)以確保兩條引物濃度一致。

　　4、酶失活時(shí)，更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。

　　5、PCR反應(yīng)條件：提高變性/退火溫度；適當(dāng)增加循環(huán)次數(shù)。

　　6、Mg2+濃度過低可影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗，而Mg2+濃度過高會(huì)降低PCR的特異性，因而可適當(dāng)提高M(jìn)g2+濃度。

　　7、如果靶序列發(fā)生突變或缺失時(shí)，也會(huì)影響引物和模板的特異性結(jié)合，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

　　Q3：非特異性條帶擴(kuò)增或者條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象

　　Answer：

　　1、當(dāng)引物特異性差或引物形成二聚體時(shí)，可重新設(shè)計(jì)引物或者使用巣式PCR

　　2、若模板或引物濃度過高，可適當(dāng)降低模板或引物濃度

　　3、酶量過多，則適當(dāng)減少酶量

　　4、Mg2+濃度偏高，則降低鎂離子濃度

　　5、退火溫度偏低，適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法（94變性，65左右退火與延伸）

　　6、循環(huán)次數(shù)過多，不僅會(huì)降低擴(kuò)增效率，且會(huì)使錯(cuò)誤摻入率增加，因此需要減少循環(huán)次數(shù)。