化工儀器網
技術文章
淺析光遺傳學技術在條件位置偏好實驗中相關行為的測試方法及注意事項
閱讀：2194 發布時間：2021-3-30【目的】與獎賞系統失調相關的情緒性疾病，如快感缺乏造成的抑郁癥、焦慮癥、自 閉癥，或過度追求獎賞刺激造成的成癮、強迫癥等疾病,嚴重影響患者日常生活。這類精神障礙疾病患病率高，發病機理不清，目前對其仍缺乏有效治療方法。2019 年中國精神衛生調查(CMHS)表明，除老年期癡呆外，6類精神障礙的終生加 權患病率為16.6%,即七分之一的居民在一生中發生至少一種精神障礙疾病。研 究這類精神障礙疾病的發病機理，尋找有效的治療方法，是神經科學界研究的重占和執占。
1、位置偏好實驗介紹及其應用
在以小鼠為模型的研究中發現，和人類一樣，小鼠也*不在追尋“快 感”，這種“快感”情緒的表現包含客觀性和主觀性兩個方面。現代神經生物學 的方法使我們能觀察到一些客觀反應的變化（比如利用電生理、雙光子鈣成像技 術等觀察神經元活性變化），隨后大腦通過皮質邊緣環路將一些客觀反應轉化成 一種愉悅情緒的主觀感受，進而產生相應的行為變化。哺乳類動物大腦的一項基 本任務就是對環境刺激的情感或動機效價進行評價，即判斷是有“利”或有“弊” 的環境，從而迅速做出靠近（approach）或者逃避（avoidance）的行為反應。在對小鼠情緒反應的研究過程中，經常會選擇一些基礎的行為學范式來對動物在 實驗過程中出現的各種不同愉悅或厭惡情緒主觀反應的判斷。比如實時位置偏好 （Real-time Place Preference, RTPP）、條件位置偏好（Conditioned Place Preference, CPP）等，根據動物對環境的選擇性靠近或逃避的主觀行為反應，來衡量環路刺激 所造成的客觀變化。
神經科學家們致力于找到一些與獎賞或厭惡情緒直接相關的腦區和神經環 路，建立因果關系，為疾病治療找到新方法。如找到一些獎賞情緒相關腦區，通 過激活該腦區或環路產生增強的“偏好”反應（如“靠近”等），或者是一些厭 惡情緒相關腦區，通過激活相應腦區或環路之后，使所見的“偏好”反應減少（如 產生“逃避”行為）。
2、位置偏好實驗的分類
常見的位置偏好實驗包括條件位置偏好和實時位置偏好。
條件位置偏好（CPP）是巴甫洛夫條件反射的一種形式，用來測量動物對某 種物體或環境的一種動機行為。主要原理是通過測量動物在與刺激相關的區域停 留的時間，來推斷出動物對刺激的喜愛或厭惡程度。
經典的條件位置偏好箱由不同環境的三個區域組成，一般分為刺激區、非刺 激區和中間區。在以往的研究中，條件位置偏好箱被廣泛的用于研究各類藥物/ 酒精成癮的形成、消退、恢復過程。主要做法是將藥物等刺激與條件位置偏 好箱一側箱體進行多次偶聯匹配刺激，經過一段時間的訓練之后，小鼠對匹配的 環境產生喜愛/厭惡，就會表現為在刺激區停留時間更長/更短。也可以根據實驗 目的對其中一些環節進行改變，探索成癮模型形成的條件等。
由于現代神經科學的迅速發展，光遺傳學已經廣泛運用于神經科學的研究， 一種基于光遺傳學技術的條件位置偏好模型被廣泛使用，它被稱為實時位置偏好。實時位置偏好通過實時激活/抑制相關神經環路，觀察動物位置偏好的差異，從 而直觀判斷刺激環路是否參與獎賞厭惡調節。
以上兩種方法通常都以小鼠或大鼠為研究對象，本文中探索ECT環路是否參 與編碼偏好行為，用到了實時位置偏好行為學模型。
主要材料和設備
| 行為測試箱 | |
| 攝像頭 | 上海欣軟 |
| 攝像頭支架 | |
| 采集卡 | 上海欣軟 |
| SuperMaze動物行為分析軟件 | 上海欣軟 |
| 473nm藍光激光器 | 杭州紐頓 |
| 75%酒精 | 鼎國 |
3、CPP實驗方法
采用的實時位置偏好(RTPP)包括連續兩天的實驗。
第Yi天為基線檢測，每只小鼠從中央箱放入之后，開始三箱的自由探索， 每只小鼠探索時間為lOmin,軟件將自動記錄小鼠運動軌跡、平均速度以及在 各箱停留的時間、進入次數等參數，將其結果記為baseline。
第二天為RTPP測試階段，任意選定一側環境箱為刺激箱(stimulate chamber),將小鼠放入中央箱，讓其自由探索，每當小鼠重心進入zhi定的刺激 箱一側時，手動給予小鼠473nm LED光照。RTPP階段，每只小鼠探索時間為 lOmin,利用欣軟公司supermaze軟件分析系統，自動實時自動記錄小鼠運動軌 跡、平均速度以及在各箱所停留的時間、進入次數等參數，將其結果記為RTPP。
(根據文獻參考以及腦區實際神經元放電模式，不同腦區給予光照刺激的刺 激頻率(frequency)、脈沖寬度(pulse width)等略有差別，BLA、NAC區均 給予雙側20Hz, 15ms刺激。每次實驗前，需用光強檢測器檢測光纖末端輸出 光強，以保證效率，本文實驗光纖末端光強為10mw左右。同時為了避免長時 間光照造成的光損傷，每個循環連續給光％后，將有2s停光間歇期，即(8s- on-2s-off)的策略)。
4、注意事項
4.1 實驗開始前一周，開始每天輕微撫摸小鼠，使小鼠熟悉實驗員氣味，熟 悉被抓弄、撫摸等。
4.2 如遇冬季或夏季，每次實驗前，提前將行為學室空調打開，避免不適宜 溫度影響小鼠行為表現。
4.3 每次實驗前，小鼠先放入行為學室適應半小時以上。
4.4 每只小鼠實驗結束后，應用75%酒精*清潔實驗箱，避免小鼠行為結 果受到上一只小鼠的氣味影響。
4.5 小鼠應該面朝墻壁放入中央區，減少人為因素對小鼠行為狀態的影響。
4.6 每次實驗的時間點應該固定，并且選定一個light cycles (7:00-19:00) 或者是black cycles (19:00-次日7:00),避免由于實驗時間點不同而影響小鼠 的基礎運動水平，造成實驗結果偏差。
光遺傳實驗時，每次實驗前用無水乙醇清潔光纖接口，避免接口被臟污 覆蓋，影響通光率。每次實驗開始前，需測定激光是否穩定，以及光強是否達 到設置標準。給予473nm LED光照激活刺激時，應避免連續長時間給光造成光損 傷，連續給光一段時間后，最hao設置適當時間的停光間歇期。
如果您也對動物實驗感興趣，歡迎關注和推薦關注\/信公眾號：bioviewer，專注于動物神經科學與行為學的實驗知識的方法傳播與分享交流，您可以推薦給您身邊的朋友、同學以及老師，我們會定期更新您需要的相關實驗方法的視頻和文章，希望能對大家帶來幫助！
