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用高分辨離子阱 LC/MS 對人參皂甙進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析
閱讀：601 發(fā)布時(shí)間：2023-6-5摘要有歷史記載以前，人們就已經(jīng)開始用草藥提取物治療疾病。通過多少代人的臨床經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)逐漸發(fā)現(xiàn)了其在人體中的活性和作用。中藥（TCM）就是一個(gè)很好的例子。天然來源的西方藥物由于其潛在價(jià)值，也越來越受到重視，但是要建立西藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，需要對天然產(chǎn)物的藥用成分進(jìn)行深入了解。本應(yīng)用報(bào)告報(bào)導(dǎo)了用 Agilent1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)結(jié)合快速分離高通量（RRHT）柱分離復(fù)雜的人參提取物中各組分的方法。用離子阱 MSn 和 MRM 獲得的信息確定各組分的結(jié)構(gòu)，并用于質(zhì)量控制。
前言有歷史記載以前，世界各地的所有古老文明都曾經(jīng)用植物和動(dòng)物源性粗提物治療疾病。幾百年的臨床經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)使人類逐漸發(fā)現(xiàn)了其治療不同疾病的活性以及對人體的其它作用，這些寶貴的經(jīng)驗(yàn)世代相傳。中藥（TCM）是這一經(jīng)驗(yàn)不斷積累、優(yōu) 化 過 程 的 最 好 例 證 。人 參 （Panaxspecies）是一種使用了 5000 多年的著名亞洲草藥。已有報(bào)導(dǎo)的人參藥理作用包括，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的刺激和抑制作用、抗高血壓、抗高血糖、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等作用 5。其主要活性化合物人參皂甙屬于三萜皂甙，目前已分離和鑒定出了 80 多種。過去 30 年來，在建立分析人參提取物和制劑的分析方法方面，人們已經(jīng)做了大量工作。分析人參等復(fù)雜天然產(chǎn)物提取物的方法，是高效液相色譜法(HPLC)[1]?，F(xiàn)在也采用 LC/MS 儀器測定復(fù)雜的和結(jié)構(gòu)相似的人參皂甙，如用LC/ESI oaTOF 進(jìn)行精確質(zhì)量測定，用LC/離子阱或 LC/三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，通過 MS/MS 和 MSn 進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析[2]。特別是可以用離子阱 MSn 碎片輪廓譜確證藥用人參產(chǎn)品的可信性及其活性成分之間的差異[3]。
本應(yīng)用報(bào)告將報(bào)導(dǎo)，用 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)與 1.8 µm色譜柱分離復(fù)雜人參提取物中的各組分。用離子阱 MSn 和 MRM 得到的信息測定各組分結(jié)構(gòu)并用于質(zhì)量控制。在本系列應(yīng)用報(bào)告的第 I 部分已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了高分離LC 系統(tǒng)與 ESI oaTOF 精確質(zhì)量測量的應(yīng)用[4]。
實(shí)驗(yàn)部分儀器• 帶脫氣機(jī)的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵。該泵能夠用于 1.8 µm 粒徑 RRHT色譜柱的高分離度 HPLC 分析，并獲得最佳性能• 帶溫度控制的 Agilent 1200 系列 SL 高效自動(dòng)進(jìn)樣器。該自動(dòng)進(jìn)樣器是為Agilent 1200 系列 SL 型二元泵確保低延遲體積而特別設(shè)計(jì)的• Agilent 1200 系列柱溫箱 (TCC)。該TCC 將與 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵和可選件分離式熱交換器，以及柱后冷卻一起使用，在優(yōu)化的延遲體積條件下，用可選件 2 位/10 通閥進(jìn)行交替色譜柱再生• Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器 (DAD)。該 DAD 能以高達(dá) 80 Hz 的采樣速率收集數(shù)據(jù)。萬一網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)問題，儀器將啟動(dòng)內(nèi)置的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)功能• Agilent 6330 離子阱 LC/MS。該離子阱配置標(biāo)準(zhǔn) ESI 源，能以 26000 m/z /秒的速度掃描?？梢詳?shù)據(jù)依賴地全自動(dòng)獲取 MSn 圖譜• 儀器控制所用的軟件是化學(xué)工作站B01.03，離子阱軟件 5.3，用離子阱數(shù)據(jù)分析軟件 3.3 分析數(shù)據(jù)• 色譜柱：ZORBAX SB-C18，2.1 x 150 mm，1.8 µm樣品粉碎的凍干人參 (1g) (Panax ginseng)加入 10 mL 甲醇，超聲處理 30 分鐘，過濾后直接分析。Agilent 6330 離子阱 LC/MS 系統(tǒng)的設(shè)置如圖 1 所示。Agilent 1200 系列 SL 型二元泵用 0.17 mm 內(nèi)徑不銹鋼毛細(xì)管與Agilent 1200 系列 SL 型高效自動(dòng)進(jìn)樣器(ALS SL)相連。為減少延遲體積，ALS SL的針座毛細(xì)管內(nèi)徑為 0.12 mm。同樣類型的毛細(xì)管連接 Agilent 1200 系列柱溫箱中的低延遲體積(1.6 µL)熱交換器，柱溫箱連接色譜柱。Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器中內(nèi)置 2 µL 流通池進(jìn)行UV 檢測。出口毛細(xì)管直接連接到 6330離子阱 LC/MS 電噴霧源的霧化器上，該儀器能以 26000 m/z/秒的速度進(jìn)行掃描。優(yōu)化儀器設(shè)置以獲得最大分離度，對人參（Panax ginseng）復(fù)雜天然產(chǎn)物提取物進(jìn)行的 UV 分析證明了這一點(diǎn)。為了驗(yàn)證其性能，對 Agilent 1100 系列 LC 系統(tǒng)（5µm 粒徑柱）和 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)（1.8 µm 粒徑柱）的分析進(jìn)行了比較[4]。在 220 nm 波長下獲得的 UV 色譜圖清楚地表明，Agilent1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)的色譜峰分離度更高。UV 色譜圖中大多數(shù)基線分離峰的峰寬 (FWHM) 小于 0.1 分鐘。高分辨配置的 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)的全部性能在另一篇應(yīng)用報(bào)告中報(bào)導(dǎo)[5]。該系統(tǒng)稍加改動(dòng)也可以用于高通量分析，這在另一篇應(yīng)用報(bào)告中有詳細(xì)報(bào)導(dǎo)[6]。
方法• Agilent 1200 系列 SL 型二元泵的操作條件如下：溶劑 A： 水 + 0.1% TFA溶劑 B： 乙腈 + 0.1% TFA流速： 0.5 mL/min梯度： 0 分鐘 5% B,1 分鐘 5 % B,60 分鐘 85 % B,61 分鐘 95 % B,70 分鐘 95 % B
停止時(shí)間： 70 分鐘后運(yùn)行時(shí)間：15 分鐘• 用 Agilent 1200 系列 SL 型高效自動(dòng)進(jìn)樣 器 進(jìn) 樣 10 µL 樣 品 ，樣 品 冷 卻 至10 oC。1 分鐘后樣品定量管切換到旁路，以縮小延遲體積• Agilent 1200 系列 SL 型柱溫箱調(diào)節(jié)到50 oC，配置低延遲體積熱交換器• 用 Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器以 80 Hz 在 220 nm/4 nm 波長（參比 360/100）下采集數(shù)據(jù)，配置 2µL 流通池，30 mm 光程• 6330 離子阱 LC/MS 在下列條件下操作：離子源： ESI 正離子模式干燥氣： 5.0 L/min干燥溫度： 300 oC霧化器： 15 psi靶標(biāo)： 125000最長累加時(shí)間： 100 ms掃描： 200-1300平均： 2MSn： 自動(dòng)化 MS/MS 和 MS3
結(jié)果與討論在高分離度 HPLC 上用 1.8 µm 粒徑色譜柱對人參粗提物中各組分進(jìn)行分離后，再使其碎裂進(jìn)行 MSn 分析。主要成分在 20到 33 分鐘之間洗脫，在基峰色譜圖中標(biāo)為人參皂甙 Re、Rf、F11、Rb1、Rb2、Rc、Rd（圖 2）。所用色譜柱的高分離度使人參提取物中大量微量化合物得到了分離，由于掃描速度高達(dá) 26000 m/z/秒，足夠采集離子阱 MS/MS 和 MSn 數(shù)據(jù)，因此這些小峰也可以被分析。本應(yīng)用深入研究了 人 參 皂 甙 Re、Rb1 和 Rc 的 離 子 阱MS/MS 和 MS3 數(shù)據(jù)，用于結(jié)構(gòu)解析，而品種依賴的 Rf 和 F11 人參皂甙分析在另一部分中討論[7]。圖 1Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)與 MS 聯(lián)用，采用低延遲體積配置95 5989-4705EN簡單 MS 掃描得到質(zhì)子化和加合形式的分子離子質(zhì)量（圖 3）。質(zhì)子化和加合離子的比值取決于電噴霧離子源的溫度，因?yàn)榧雍蠌?fù)合物在高溫下比質(zhì)子化離子更穩(wěn)定，后者將發(fā)生裂解，丟失一個(gè)水和其它碎片。人參皂甙 Re 質(zhì)譜掃描產(chǎn)生的離子有 m/z 928.9 [M+H-H2O]+、946.9[M+H]+、969.1 [M+Na]+；人參皂甙 Rb1產(chǎn) 生 的 離 子 是 m/z 1090.1 [M+HH2O]+、1108.5 [M+H]+、1131.1 [M+Na]+；人參皂甙 Rc 則得到離子 m/z 1059.71[M+H-H2O]+、1077.75 [M+H]+、1101.1[M+Na]+。 選 擇 6330 離 子 阱 質(zhì) 譜LC/MS，MS/MS 和 MS3 條件產(chǎn)生加合離子。與質(zhì)子化離子相比，這些離子的裂解能得到更清晰、更多的結(jié)構(gòu)信息，其碎片與本研究第 I 部分討論的 CID 碎片相似[4]。