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白毛茛中生物堿的提取和HPLC 分析
閱讀：520 發布時間：2023-5-15摘要本文建立了對白毛茛根粉末中生物堿進行室溫萃取，并用Zorbax 快速分離 Eclipse XDB-C18 柱進行 HPLC 分析的方法，用該法準確測定了白毛茛中包括小糪堿和白毛茛堿在內的主要生物堿。也可以用這一萃取和 HPLC 分析方法測定其它生物堿，包括氫化小糪堿、白毛茛分堿和巴馬亭。還可以應用于其它含小糪堿的植物根的分析。Eclipse XDB-C18 快速分離柱采用等度分離，所有組分在 15 分鐘內實現了高分離度分離。
前言白毛茛(goldenseal)，學名 Hydrastis canadensis L.，是最老的草藥植物之一，其作為天然藥物正在受到人們的關注。白毛茛中存在的兩種主要生物堿——小糪堿和白毛茛堿——被認為是其中的活性成分。氫化小糪堿、白毛茛分堿、5-羥基小糪堿和 canadaline 都是含量很小的生物堿。巴馬亭與小糪堿密切相關，但在白毛茛中沒有檢測到，而在另一種含小糪堿的植物——黃連(Coptis)中卻檢測到了巴馬亭[1]。白毛茛已被用作消炎藥和抗生素。也用作治療鼻充血、感冒、流感和多種腸道紊亂。該植物的整個根部都用來入藥，目前市售的劑型有散裝（干燥或粉末化的白毛茛根）、片劑、膠囊和酊劑。由于野生白毛茛已經被過度采集，現在大量的白毛茛由人工種植，以補充草藥來源。作為草藥補充物銷售的白毛茛質量參差不齊，其中的活性生物堿含量差異很大。因此，迫切需要一種簡單的方法進行生物堿的萃取和分析，以評價產品的質量。圖 1 顯示了白毛茛中生物堿的化學結構。
實驗部分萃取步驟Betz 和 Anderson[1]以及 Burney[2]曾報導了室溫條件下從白毛茛中萃取生物堿的方法。按照此方法進行萃取，然后采用HPLC液相色譜 對生物堿提取物進行精確定量分析。純白毛茛根粉末的優化室溫萃取條件總結如下：1. 稱取約 0.5 g 白毛茛根粉末2. 加入 100 mL 乙腈:水:H3PO4 (70:30:0.1，v/v/v)，混勻3. 超聲處理 5 分鐘，振搖（手腕抖動）10 分鐘，離心 5 分鐘4. 5 倍稀釋萃取物5. 稀釋后的萃取物直接進行 HPLC 分析
HPLC 分析白毛茛中生物堿的 HPLC 分析，要求能夠分離主要的生物堿。此外，還需要能夠分離巴馬亭，因為它存在于其它含有小糪堿的植物中。我們開發了一種能夠分離所有這些組分的 HPLC 方法。采用 Zorbax Eclipse XDB-C18 色譜柱、醋酸銨緩沖液和乙腈混合流動相，可得到最佳的分離度和峰形。圖 2 顯示了分離結果，并列出了所采用的全部優化分離條件。為獲得一致的保留時間，溫度控制在 30°C[3]。
方法驗證采用本 HPLC 方法可對室溫萃取方法進行驗證。本方法研究了線性、精度和生物堿的回收率。表 1 列出了這些結果。方法的精度良好，不同生物堿的回收率范圍在 92%-102%，適用于定量分析。線性很好（圖 3），靈敏度良好。通過標樣數據計算出的小檗堿的檢測限(LOD)為 0.50 mg/mL，定量限(LOQ)為1.65 mg/mL。因此可以對低水平含量的小檗堿進行精確定量，適用于檢測不同來源白毛茛產品的質量。
結果白毛茛的測定采用室溫萃取方法和 HPLC 分析方法測定來自 3 個不同供貨商的 6 批白毛莨根粉末樣品中生物堿的含量，結果列于表 2。這些結果說明來自不同供貨商的樣品的質量是不同的，也說明了需要一個很好的 HPLC 定量分析方法的原因。
結論白毛莨室溫萃取法簡便而可靠，萃取物采用 Zorbax EclipseXDB-C18 快速分離色譜柱進行等度 HPLC 分析，在 15 分鐘內獲得了 6 種生物堿的分離結果，分離度高，峰形好。該分析方法提供了包括小檗堿和白毛莨堿在內的白毛莨生物堿含量的可靠定量結果。該方法已通過分析來自 3 個不同供貨商的白毛莨得到了驗證，預期也可用于其它含小檗堿植物的分析。