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液相色譜儀和蒸發光散射檢測器分析中藥柴胡
閱讀：826 發布時間：2023-3-19摘要本文闡述了用于柴胡分析的傳統 HPLC 和高分離度快速液相色譜（RRLC）方法的開發。對不同柴胡樣品指紋圖譜的比較顯示了不同產地采集的中藥具有不同的色譜峰形。優化了 Agilent 1200 系列蒸發光散射檢測器的方法參數，可得到最大的響應值。開發了測定不同中藥及其制劑中六種柴胡皂苷含量的定量方法。
前言柴胡為傘形科植物北柴胡（BupleurumChinese DC） 或 狹 葉 柴胡（ B.scorzonerifolium）的干燥根，是最為常用的中藥材之一。參照《中國藥典》1，B.Chinese DC 和 B. scorzonerifolium （傘形科）分別習稱為“北柴胡"和“南柴胡"。除了北柴胡與南柴胡，中國還有其他藥材品種以柴胡入藥。許多的中成藥復方制劑中用到柴胡，它可以用于治療感冒發熱。柴胡中含有多種成分，其中柴胡皂苷被認為與治療作用關系最大。曾有報道使用HPLC 以紫外檢測器在 210 nm 以下的低波長處對多種柴胡中的柴胡皂苷進行測定。使用甲醇等有機溶劑進行梯度洗脫時，以如此低的檢測波長不可能得到平穩的基線。基線的漂移可能對定量分析產生影響，因為色譜峰可能無法得到正確的積分。柴胡中的一些柴胡皂苷是多萜類皂苷，僅在低波長處具有紫外吸收。另一些柴胡皂苷具有二烯結構，因此較易進行紫外檢測。在柴胡的切片或 HPLC 樣品制備過程中當處于高溫和低 pH 條件時，多萜類皂苷不穩定，易轉化為二烯結構。
LC/MS 也已用于柴胡的研究，其檢測限更低，靈敏度更高，但是儀器設備較為昂貴，而且要求操作人員具備質譜知識。目前，趨向于使用蒸發光散射檢測器（ELSD）分析柴胡，在中國的科學期刊上已有多篇論文發表 2,3。ELSD 可用于檢測所有比溶劑揮發性小的被分析物，能夠保持平穩的基線，而與溶劑的紫外吸收或梯度條件無關。柴胡皂苷含有 1 個或 2 個雙鍵，在 ELSD 上的信號沒有差別。一些在低波長處有紫外吸收的揮發性組分，使用ELSD 時沒有響應，因此在對柴胡皂苷進行定量分析時不會對積分產生干擾。柴胡的指紋圖譜對于鑒定其產地非常重要。柴胡中除了柴胡皂苷以外的其他成分也對治療作用具有不同的貢獻。為獲得柴胡的全面信息，應同時使用 UV 檢測器和ELSD 以檢測柴胡皂苷和其他成分的色譜峰。
根據參考文獻，傳統 HPLC 方法分離幾種柴胡皂苷需要 50 分鐘。為加速分析進程，RRLC 越來越引起人們的關注。RRLC 在保持分析性能的同時，可以縮短運行時間并降低成本。本文中同時應用了兩種方法，對不同的液相色譜系統配置給出參考。對不同樣品得到的不同譜圖進行了討論，同時，定量分析結果顯示不同樣品中柴胡皂苷的含量也有差異。
實驗部分標樣和試驗材料6''-乙酰基-SSa (3)、3''-乙酰基-SSd (5) 和6''-乙酰基-SSd (6) 是在實驗室中從中藥柴胡的根部分離得到。SSa (2) 和 SSd (4) 購自中國藥品生物制品檢定所（中國北京）。SSc (1) 購自中藥固體制劑國家研究中心（中國江西）。通過光譜數據（UV、MS、1HNMR 和 13C NMR）與文獻值的比較，對這些化合物的結構進行解析。研究用原料藥材由研究組成員收集而得。
儀器一臺 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統同時用于傳統 HPLC 和 RRLC 方法的開發。該系統包含以下模塊：• Agilent 1200 系列 SL 型雙泵，帶真空脫氣機• Agilent 1200 系列 SL 型高效自動進樣器• Agilent 1200 系列 SL 型柱溫箱• Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器，具備微量流通池（容量 2 µL，光程3 mm）• Agilent 1200 系列蒸發光散射檢測器，帶標準噴霧器• Agilent ChemStation，軟件版本 B.03.02，用于儀器控制、數據采集和評價
圖 2 顯示了使用 RRLC 方法的分析結果，運行時間由 60 分鐘縮短為 6 分鐘。色譜圖基線平穩，而且色譜峰分離良好。洗脫順序與傳統 HPLC 方法一致，因為兩種色譜柱使用了同一種鍵合類型的填料
參照《中國藥典》，錐葉柴胡（25 號樣品）并非典型的柴胡。然而，實際上一些老中醫仍然使用這種柴胡。圖 3 為 ELSD 和UV 檢測所得色譜圖。與典型柴胡相比，25 號樣品的 HPLC 譜圖中有更多的色譜峰。通過比較 ELSD 和 UV 信號，兩類色譜峰能夠得到識別。這證明 ELSD 和 UV檢測器因為能夠檢測不同種類的化合物而具有互補作用。第一類色譜峰中化合物的揮發性比溶劑強，并且含有發色團。第二類色譜峰中化合物的揮發性較溶劑弱，且不含發色團。這些色譜峰的化合物結構仍然未知。將這些結果與藥理學研究相結合，能夠揭示是否這些色譜峰中的化合物具有治療作用。
