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三重串聯四極桿質譜進行多種藥物血漿穩定性的快速方法
閱讀：633 發布時間：2023-2-14引言穩定性差的化合物往往生物利用度低。特定官能團（如酰胺、酯以及內酯等）有利于使化合物成為血漿酶（如水解酶和酯酶）的靶標。對新化學實體（NCE）血漿穩定性曲線的研究有助于對其分子結構進行修飾以改善物理化學性質，并且可為后續研究開發選擇更適合的分子。本研究中，快速分離 LC/MS/MS 用于研究十種藥物化合物的血漿穩定性。其中包括四種β受體阻滯劑（阿替洛爾、拉貝洛爾、美托洛爾和普萘洛爾）、一種鈣通道阻滯劑（維拉帕米）、一種 5-羥色胺受體激動劑和四種抗抑郁藥（奈法唑酮、去甲替林、丙咪嗪和曲米帕明），該分析采用利血平作為內標。尤卡托品是一種眼科藥物，被用作對照樣，以美托洛爾為內標進行分析。
實驗部分試劑和藥品阿替洛爾、拉貝洛爾、美托洛爾、普萘洛爾、奈法唑酮、去甲替林、丙咪嗪、曲米帕明、維拉帕米、尤卡托品和利血平購自印度班加羅爾的 Sigma-Aldrich公司。HPLC 級乙腈和甲醇均購自 Lab-Scan公司。甲酸購自 Fluka 公司。用于方法開發的目標分析物的儲備液和標準溶液用甲醇進行配制。
樣品制備血漿用 0.1M 的鹽酸或 0.1M 的氫氧化鈉調節 pH 值到 7.4。待測化合物溶解在 DMSO（二甲基亞砜）中，終濃度為 10mM，然后用 DMSO 稀釋至 40µM。孵育實驗中待測化合物的濃度為 1µM，DMSO 的終濃度為 2.5%。將 195µL 的血漿加入一個 96 孔板，然后分別加入 5µl 待測化合物。加標血漿樣品于 37°C 孵育 2 小時。分別在0、15、30、60 和 120 分鐘時加入 400µL 利血平（內標）甲醇溶液終止反應。同時，含有尤卡托品（對照化合物）的血漿樣本加入 400µL 美托洛爾（內標）甲醇溶液終止反應。此外，將僅含內標的甲醇溶液加入血漿樣品，制備不含任何被分析物或對照化合物的基質空白。樣品板在 4°C，2500rpm 離心 45 分鐘，上清液轉移到一個新的 96 孔板供 LC/MS-MS 分析。
儀器Agilent 1200 系列快速分離液相色譜系統（包括一個微型真空脫氣機、二元泵、帶溫控系統的高性能自動進樣器和柱溫箱）與 Agilent 6460 三重串聯四極桿質譜儀聯用。質譜儀為 ESI 模式，采用安捷倫噴射流技術。采用 Agilent MassHunter 工作站（版本 B.02.00）進行數據采集，MassHunter 定量分析軟件（版本B.01.04）進行數據分析。采用 AgilentMassHunter Optimizer 軟件（B.02.00）優化兩個重要的 MS 參數：碎裂電壓和碰撞能量。Optimizer 還可給出本研究中豐度最高的 MRM 離子對。
結論本文建立了評價十種藥物化合物血漿穩定性的 LC 方法和質譜條件。采用MassHunter Optimizer 軟件確認選定母離子的響應強的子離子。該軟件也給出了最佳的碎裂電壓和碰撞能量。這樣，很快地建立了標準品的質譜分析方法。研究表明，本文建立的方法可用于不同種類化合物的血漿穩定性考察。