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糖果中色素添加劑的分析-安捷倫應用解決方案
閱讀：683 發布時間：2022-4-24摘要:合成或人工色素在食品和飲料中作為添加劑，可以改善產品的外觀。在本研究中，我們開發了一種穩定的反相高效液相色譜 (RP-HPLC) 方法，實現了 10 種合成色素的同時測定。采用配有 Agilent Poroshell EC-C18 色譜柱的 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統實現分離和定量分析。通過部分驗證確定了方法的穩定性。通過分析糖果中的色素添加劑，證明了該方法定量分析食品基質中人工色素的適用性。最后，將 HPLC 方法有效轉換為一個耗時短的超高壓液相色譜 (UHPLC) 方法，采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統，實現更快速的分析，且不損失分離度。采用 Agilent 1290 Infinity 二極管陣列檢測器 (DAD)，可以選擇不同的波長，實現在不同色素各自的最大吸收波長處進行定量測定。采用兩種方法，分別確定了每種色素的檢測限 (LOD)、定量限 (LOQ)、精密度、準確度和線性。在分析工作流程中采用 Agilent 7696A 樣品制備工作臺，幫助在LOD、LOQ 和線性研究中進行樣品前處理。
前言色素添加劑是指加入食品中使其帶顏色的任何染料、色素或物質1。當前有主要來源于植物或動物的天然和合成色素添加劑。如：姜黃和藏紅花。合成色素是化學合成的色素，如酒石黃和靛胭脂2。在食品中加入色素有許多原因。其中包括補償因長期儲存出現的褪色、糾正顏色的自然變化，以及使無色食品著色等。實際上，色素添加劑是市場上大多數包裝食品不可避免的一類成分1。研究業已證明，人工色素暴露量超出每日攝入*將會導致兒童產生多動癥和其他不安行為3。美國食品藥品監督管理局 (FDA) 已經制定了相關條例，旨在控制和確保食品中僅含有允許使用的色素添加劑。這就強調了使用精確的分析技術對色素進行鑒別和定量分析的重要性。在本文中，我們采用 Agilent Poroshell120 EC-C18 色譜柱，開發了一個反相高壓液相色譜方法。食品色素的水溶性使反相 HPLC 成為分析這些物質的理想技術。
方法儀器與軟件Agilent 1260 Infinity 四元液相色譜系統包括如下模塊：• Agilent 1260 Infinity 四元泵和真空脫氣機 (G1311B)• Agilent 1260 Infinity 高效自動進樣器(G1367E)• Agilent 1260 Infinity 柱溫箱 (G1316A)• 帶最大光強流通池（60 mm 光程）(G4212-60007) 的 Agilent 1260Infinity 二極管陣列檢測器 (G4212B)• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，4.6 x 150 mm，2.7 µm (693975 902)開發和運行 UHPLC 分析所使用的 Agilent1290 Infinity 液相色譜系統包括：• 集成了真空脫氣機 (G4220A) 和 100 µLJet Weaver 混合器的 Agilent 1290Infinity 二元泵• Agilent 1290 Infinity 高效自動進樣器(G4226A)• Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)• 帶最大光強流通池（1.0 µL 擴散體積，10 mm 光程）(G4212-60008) 的 Agilent1290 Infinity 二極管陣列檢測器 (G4212A)• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，內徑 2.1 mm，柱長 75 mm，采用 2.7 µm顆粒填充 (697775-902)兩套系統均采用安捷倫化學工作站（B.04.02 版）進行控制。系列線性濃度稀釋樣品采用 Agilent 7696A樣品制備工作臺制備。
試劑與材料所有化學品和溶劑均為 HPLC 級，高純水使用 Milli Q 水純化系統（Millipore Elix10 型，美國）制備。甲醇為超梯度級，購自 Lab-Scan 公司（泰國曼谷）。磷酸氫二鈉和正磷酸購自 Fluka 公司（德國）。二甲基亞砜 (DMSO) 購自 Qualigens 公司（印度）。酒石黃、莧菜紅、靛胭脂、胭脂紅 4R、日落黃 FCF、紅色酸性染料、固綠 FCF、酸性藍/亮藍、胭脂紅 3R，以及赤蘚紅 B 標準品購自 Aldrich 公司（印度）。用于回收率和定量分析的糖果購自本地。
色譜參數反相液相色譜和 UHPLC 中使用的色譜參數見表 1。
色素標準溶液稱取各標準品約 20 mg，分置于 10 mL 容量瓶中，分別制備酒石黃、莧菜紅、靛胭脂、胭脂紅 4R、日落黃 FCF、紅色酸性染料、固綠 FCF、酸性藍/亮藍、胭脂紅 3R，以及赤蘚紅 B 的標準儲備液。于每個容量瓶中加入 300 µL DMSO，將流動相 A 和 B 按照 80:20 的比例預混合的溶液作為稀釋劑。需要時超聲處理。混合標準溶液和線性濃度精確量取各標準溶液約 100 µL 并混合，加入稀釋劑至 2000 µL，得到每種色素濃度均為 200 ppm 的色素標準混合溶液。使用 Agilent 7696A 樣品制備工作臺連續稀釋該 200 ppm 標準混合溶液，制備系列線性濃度的標準溶液。線性標準溶液的濃度范圍為 0.01 ng/µL – 200 ng/µL（10 個濃度水平及各重復 6 次）。
用于色素定量分析和回收率研究的樣品前處理使用不同類型的樣品（即包含不同色素的糖果）進行色素定量分析和回收率研究。依次向 2 g 糖果中加入 400 µL DMSO 和20 mL 稀釋劑，提取其中的色素，過程非常簡單。超聲處理并采用帶有 C0650轉子的 Beckman Coulter Allegra X22R 離心系統，以 8300 rcf 的離心力離心 10 min后，溶液通過 0.25 µm PTFE AgilentEconofilter 注射式過濾器濾膜過濾，濾液待分析。使用加標和不加標的糖果樣品進行回收率研究。樣品加標采用柱上濃度為 25 ng 的標準混合溶液。提取過程如前所述。
預防措施為了延長化合物在溶液中的穩定性，不使用時，所有制備的溶液用鋁箔包裹，并于冰箱暗處 4 °C 貯存。分析期間，可恒溫的自動進樣器樣品盤保持在 5 °C。步驟表 2 所示的系列濃度校準溶液是采用稀釋劑系列稀釋 200 ng/µL 標準混合溶液而得。在兩個系列溶液的配制中，采用帶500 µL 注射器的 Agilent 7696A 樣品制備工作臺來配制線性濃度的溶液。在第一序列，向每個樣品瓶中加入一定量的稀釋劑；在第二序列，將 250 µL 200 ng/µL的溶液加入樣品瓶并渦旋 15 s。注意,除了分別運行這兩個序列外，這些步驟也可以在一個方法中編程并在一個序列中運行。取上一個濃度的溶液 250/100 µL置于下一個濃度的樣品瓶中進行系列稀釋。Agilent 7696A 樣品制備工作臺設置的注射器參數見表 3。Agilent 7696A 樣品制備工作臺4 的設置在安捷倫應用簡報（出版號 5990 6850CHCN）中有詳細描述。進樣分析 5 µL 含有 DMSO 的稀釋液作為空白，然后依次進樣分析系列濃度的各校準溶液，每個濃度平行分析 6 次。用每個濃度的峰面積和保留時間 (RT) 數據來計算標準偏差 (SD) 和相對標準偏差 (RSD)值。并以較低線性濃度溶液的進樣分析確定 LOD 和 LOQ。以各色素每個線性濃度峰面積的平均值對其相應濃度作圖，構建線性曲線。
通過改變 6 個關鍵的方法參數來評估方法的穩定性。平行 6 次進樣分析含每種色素各約 30 ng（柱上量）的標準混合溶液，利用獲得的數據來研究方法的穩定性。分別進樣分析 2 g 糖果中加標 25 ng 色素添加劑標準品和不加標的樣品溶液，來研究方法的回收率。利用所有 10 種色素標準品的特征圖譜建立其 UV 譜庫。連同保留時間，該譜庫可用來鑒定糖果中的色素添加劑。該方法可有效轉換到 UHPLC。評價了每種色素的 LOD、LOQ 和線性，方法精密度通過峰面積和 RT 的 RSD 來確定。同時還繪制了所有色素使用 UHPLC 方法的線性曲線。UHPLC 方法可使分析更快速，并且不損失分離度
結果與討論分離與檢測采用 Agilent Poroshell 120 EC-C18（150 mm x 4.6 mm，2.7 µm）色譜柱，這 10 種色素在 20 min 內實現了良好分離。不同的色素具有不同的最大吸收波長。這 10 種色素的色譜流出曲線見圖 1，色素列表及其各自的最大吸收波長見表 4。我們使用化學工作站軟件中的峰純度功能檢查各色譜峰的純度，從而評價了方法的專屬性。通過對精密度、線性范圍、準確度、專屬性、回收率和穩定性進行研究來驗證本方法。
檢測限 (LOD) 與定量限 (LOQ)信噪比 (S/N) > 3 時的分析物濃度定義為LOD，S/N > 10 時的分析物濃度定義為LOQ。測得的每種色素的 LOD 和 LOQ 值見表 5。作為一個實例，圖 2 展示了胭脂紅 4R LOQ 濃度（柱上量 0.1 ng）時與空白的疊加色譜圖。
線性所有制備的線性濃度溶液平行進樣分析6 次，利用峰面積響應及其相應的濃度值來構建每種色素從 LOQ 濃度到最高濃度的線性曲線。獲得的所有色素的相關系數