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生物惰性液相色譜儀的利妥昔單抗創新藥物和生物仿制藥的電荷異構體 分析
閱讀：1366 發布時間：2021-4-27摘要：監測生物藥物的電荷異質性對于生產安全有效的藥物至關重要，因為電荷分 布的改變可能會引起不良免疫反應。本應用簡報展示了對利妥昔單抗創新藥 物及其生物仿制藥的電荷異構體的分析。電荷異構體在峰型模式方面表現 出相似性，但是創新藥物與生物仿制藥的單峰的強度則存在明顯差異。從 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色譜儀轉換為 Agilent 1260 Infinity II 生物惰 性液相色譜儀，所獲得的分析結果相當。結果還表明保留時間具有優異的一 致性，最大偏差小于 0.5%。兩種系統在保留時間和峰面積方面獲得了高精 度的結果。
前言：儀器間的方法轉移對不同行業的實驗 室而言都是一項重要課題1 。對于制藥 及生物制藥行業中經驗證的方法，由 于實驗室現代化的發展等因素，必須 實現從一臺儀器到另一臺儀器的等效 方法轉換。 隨著生物制藥行業的發展，出現了 許多昂貴的新興單克隆抗體 (mAb) 藥 物，這導致了低價生物仿制藥的不斷 開發。對創新藥物與生物仿制藥的比 較研究對于評估生物仿制藥 mAb 的安 全性和有效性至關重要。這些廣泛的 研究包括重要的質量屬性，例如滴度 分析、聚集研究、電荷異構體和糖基 化分析、肽譜分析等。兩種最重要的 質量屬性是聚集研究以及電荷異構體 分布的分析²。本應用簡報中使用的 mAb 為利妥昔單抗的創新藥物及生物 仿制藥，此類藥物與多藥化療法一起 用于治療彌漫大 B 細胞淋巴瘤³。 本應用簡報使用弱陽離子交換色譜法 (WCX) 分析了利妥昔單抗創新藥物及 生物仿制藥的電荷異構體分布情況。 對兩種不同的生物惰性系統（Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色譜儀和 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色譜儀）進行比較以證明所測試的兩種 系統的等效性。
實驗部分：儀器 本實驗在 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色譜系統和 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色譜系統上完成。該系 統包括以下模塊： Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液 相色譜系統 • Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元 泵 (G5611A) • Agilent 1260 Infinity 高性能生物惰 性自動進樣器 (G5667A) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1330B)，用于樣品冷卻 • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)，配備生物惰性溶劑熱 交換器 • Agilent 1260 Infinity 二極管陣列檢 測器 (G1315C)，配備 10 mm 生物 惰性標準流通池 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性四元 液相色譜系統 • Agilent 1260 Infinity II 生物惰性泵 (G5654A) • Agilent 1260 Infinity II 生物惰性 Multisampler (G5668A)，配備樣品 冷卻裝置（選件 #100） • Agilent 1260 Infinity II 高容量恒溫 箱 (G7116A)，配備生物惰性熱交 換器（選件 #019） • Agilent 1260 Infinity II 二極管陣列 檢測器 WR (G7115A)，配備生物 惰性流通池（選件 #028）
色譜柱 Agilent Bio mAb，非多孔，2.1 × 250 mm， 5 µm HPLC 色譜柱，PEEK（部件號 5190-2411） 軟件 • Agilent OpenLAB CDS 2.1 版 • 安捷倫緩沖液顧問軟件 A.01.01 [009] 使用 Agilent OpenLAB CDS 2.1 版軟件 進行液相色譜儀控制和液相色譜數據 分析。OpenLAB CDS 2.1 版軟件提供了 用于液相色譜、氣相色譜和單四極桿 質譜的單個軟件系統。它具有直觀的 用戶界面，以及可采用拖放式模板創 建的定制化交互式報告功能。 樣品 利妥昔單抗創新藥物和生物仿制藥樣 品購自印度當地的藥店。 化學品 所有試劑均為液相色譜級。新制超 純水產自配置 0.22 μm 膜式終端過濾 器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水純化 系統。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和氯 化鈉購自 Sigma-Aldrich 公司 (St. Louis, USA)。
結果與討論： 離子交換色譜的方法開發通常從 pH 篩選開始，通過 pH 篩選找到分離電 荷異構體的最佳色譜條件。在分離利 妥昔單抗電荷異構體的過程中，選擇 磷酸鹽緩沖梯度，使用氯化鈉實現離 子強度的線性提升。能夠使磷酸鹽緩 沖液實現最佳緩沖容量的 pH 范圍處 于 6 至 7.5 pH 之間。因此，pH 篩選 從 pH 6.2 開始，并以 0.2 的增量逐漸 提高至 pH 7.2。圖 1 顯示了使用利妥 昔單抗生物仿制藥得到的 pH 篩選色 譜圖。根據所調節的 pH 不同，觀察 到保留時間以及分離度方面存在明顯 差異。利用安捷倫緩沖液顧問軟件計 算四元梯度，對所有調節的 pH 值采 用相同的四種儲備液。結合由緩沖液 顧問軟件計算得到的動態混合四元梯 度，可縮短并簡化 pH 篩選工作流程4 。 特別是，與人工配制用于預混合的雙 組分梯度的緩沖液相比，使用緩沖液 顧問軟件計算得到的動態混合梯度能 夠顯著減少緩沖液配制時間。此外， 它可以避免中斷分析序列以引入并沖 洗新的緩沖液組分，選擇 pH 6.8 以實 現最高的分離度，并用于所有后續的 分析。