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2D-LC/MS/MS 在藥物生物分析中的優勢-避免基質效應
閱讀：1011 發布時間：2021-1-5摘要 ：本應用簡報展示將 Agilent InfinityLab 二維液相色譜解決方案與 Agilent 6495 三重 四極桿液質聯用系統結合使用，分析藥代動力學研究中的藥物及其代謝物。二維液 相色譜可避免出現共洗脫，因此能夠減少信號抑制以及交叉干擾風險，這些問題可 能存在于復雜樣品的一維分析中。通過以更適合的洗脫方式將分析物引入質譜離子 源，2D-LC/MS/MS 分析方法的第二維可用于提高質譜檢測的信號強度。
前言 ：在過去十年間，LC/MS/MS 已成為了藥 代動力學研究中用于分析藥物及其代謝物 的一項成熟技術。這項技術除高選擇性、 高分析靈敏度以及在峰歸屬或分子量信息 等方面具有明顯優勢以外，也遇到了一些 *的困難，如難以對血漿或細胞培 養基等基質復雜的生物樣品進行分析。另 外，還存在同質異位素共洗脫或代謝物源 內碎裂導致的交叉干擾，以及基質組分共 洗脫導致的信號抑制等挑戰。信號抑制的 問題在低濃度分析物定量時尤為突出，可 能造成定量限不達標。 就如何將 Agilent InfinityLab 二維液相色 譜解決方案與 Agilent 6495 三重四極桿液 質聯用系統結合在生物分析研究環境中克 服上述難題，本應用簡報詳細列舉了兩個 示例，分別是： • 二維分離方案如何避免出現共洗脫， 以及如何在處理復雜分析物混合物時 降低交叉干擾風險或減少信號抑制 • 如何利用第二維通過改變洗脫條件提 高質譜檢測的信號強度，從而以更適 合的洗脫液將分析物引入質譜離子 源，大幅提高定量限
實驗部分： 設備 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜系統 包括以下模塊： • 兩臺 Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配備冷卻裝置（選件 #100） • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B) • Agilent 1290 Infinity 閥驅動 (G1170A)，配備 2 位/4 通雙向閥 （二維液相色譜閥 1300 bar：部件號 5067-4244） • 兩個 Agilent 1290 Infinity 閥驅動 (G1170A)，配備帶 40 µL 定量環的多 中心切割閥 (G4242-64000) • 質譜 (MS) 檢測采用配備安捷倫噴射 流電噴霧離子源 (G1958-65538) 的 Agilent 6495 三重四極桿液質聯用系 統進行
軟件 • Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版，版本 C.01.07 SR2 [263] 以及二 維液相色譜軟件，版本 A.01.03 [025] • Agilent MassHunter 工作站 LC/MS 數據采集軟件，版本 B.08.00，Build 8.0.8023.5 SP1 • Agilent MassHunter 工作站定量分析 軟件，版本 B.07.01，Build 7.1.524.0
化學品 LC/MS 級乙腈和甲醇購自 TH Geyer (Renningen, Germany)。LC/MS 分析所 使用的甲酸和乙酸銨購自 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。 新制超純水產自配置 0.2 µm 膜式終端 過濾器的 ELGA Pureflex 2 水純化系統 (Veolia Water Technologies Deutschland GmbH, Celle, Germany)。 樣品和方法 利用二維液相色譜避免信號抑制和交叉 干擾 進行體外細胞懸液測定，鑒定負責候選藥 物代謝的關鍵酶。在細胞懸液中對候選藥 物（小分子）和多種酶特異性探針底物及 相應酶抑制劑進行溫育。經過一段時間 后，收集樣品并分析代謝物的形成。為避 免信號抑制或交叉干擾，采用色譜法對高 豐度底物和抑制劑進行了分離。進樣溶液 中含有細胞上清液與穩定同位素標記內標 溶液的混合物。方法參數如表 1 所示。 二維液相色譜通過溶劑切換提高質譜檢 測靈敏度 通過體外細胞培養測定評估母體化合物 （候選藥物）及其三種主要代謝物在培養 基和細胞中的濃度。在預設溫育時間結束 后采集樣品，加入非穩定同位素標記的內 標，然后進樣。方法參數如表 2 所示。
結果與討論 利用二維液相色譜避免信號抑制和交叉 干擾 在酶底物和抑制劑存在的條件下，體外細 胞懸液測定得到的細胞培養上清液中含有 各種代謝物，因此屬于復雜混合物。圖 1 所示為細胞培養上清液的 LC/MS/MS 分 析結果。突出顯示的代謝物 M1 與濃度更 高的底物和抑制劑發生了共洗脫。在此次 LC/MS/MS 分析中，代謝物 M1 發生信號 抑制，原因是該代謝物與豐度更高的底物 和抑制劑發生了共洗脫。對于結構相關化 合物，還可能有交叉干擾的問題。 要避免信號抑制和交叉干擾，分析細胞上 清液時需要采用一種能夠將代謝物與底物 和抑制劑分離開來的色譜方法。