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技術(shù)文章
用高分離度快速液相色譜-UV和MS檢測 建立可靠的中藥制劑質(zhì)控方法
閱讀：753 發(fā)布時間：2019-7-1引言：中國長期使用中藥和中藥制劑，對其治療作用有豐富的經(jīng)驗。但質(zhì)量控制僅局限在外觀檢查是不夠的。隨著新技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些中藥中有幾百種化合物，其濃度范圍很寬。而且，產(chǎn)地不同和采摘時期不同，以及炮制和加工工藝不同，中草藥的成分也不同。因此，對中藥化合物的質(zhì)量控制挑戰(zhàn)性?，F(xiàn)在，只測定中藥制劑中一個或兩個成分進行質(zhì)量控制已經(jīng)不夠了，因為特殊配方的中藥制劑都是由一種以上中藥組成的。例如，芪參益氣滴丸，一種用于治療冠心病的中成藥，包含4種中藥：黃芪、丹參、三七、降香
本研究以芪參益氣滴丸為樣品，用高分離度快速液相色譜（RRLC）-紫外-可見檢測器和質(zhì)譜聯(lián)用，建立中藥質(zhì)量控制的新方法。主要目標是建立一種可靠的方法，能夠選測定在加熱和混合過程中不變的潛在目標化合物。
實驗儀器
Agilent 1200系列RRLC系統(tǒng)包括：帶真空脫氣機的SL 型二元泵、SL型高性能自動進樣器、配置微量流通池(2 μL體積，3 mm光程)的SL型柱溫箱和二極管陣列檢測器SL，
Agilent 6410四極桿質(zhì)譜儀，配置ESI離子源
Agilent 化學工作站B.02.01 SR1，用于數(shù)據(jù)采集和分析
Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT色譜柱，3.0 x 50 mm, 1.8 μm粒徑
標準品
丹酚酸B、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參素、三七皂甙R1和黃芪甲苷均購自中國藥品生物制品檢定所(NICPBP)，人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1、原兒茶醛、原兒茶酸、人參皂甙Re和人參皂甙Rc 購自Sigma-Aldrich 公司（美國）。
溶劑
乙腈購自Fisher 公司（美國），水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。
樣品和樣品制備
芪參益氣滴丸、黃芪、丹參、三七的中間提取物，及降香精油，由中國TASLY制藥公司提供。原藥材購自當?shù)刂兴幍辍?/span>
滴丸、中藥提取物和中藥原料溶于70 %甲醇/水溶液中，超聲提取30分鐘，用0.22 μm濾膜過濾。
RRLC方法
流動相：
A: 0.1 %甲酸水
B: 乙腈，含0.1 %甲酸
梯度：0分鐘，10 %B；8分鐘，38 %B；12分鐘，100 %B；持續(xù)3分鐘，然后10 %B
流速： 1.0 mL/min（ 被動分流器將進入M S 的流速降至0.4 mL/min）
柱溫：45 °C
檢測波長：203 nm
峰寬：0.5 s
狹縫寬度：4 nm
光譜：190-400 nm，2 nm步進
標準品
丹酚酸B、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參素、三七皂甙R1和黃芪甲苷均購自中國藥品生物制品檢定所(NICPBP)，人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1、原兒茶醛、原兒茶酸、人參皂甙Re和人參皂甙Rc 購自Sigma-Aldrich 公司（美國）。
溶劑
乙腈購自Fisher 公司（美國），水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。
樣品和樣品制備
芪參益氣滴丸、黃芪、丹參、三七的中間提取物，及降香精油，由中國TASLY制藥公司提供。原藥材購自當?shù)刂兴幍辍?/span>
滴丸、中藥提取物和中藥原料溶于70 %甲醇/水溶液中，超聲提取30分鐘，用0.22 μm濾膜過濾。
RRLC方法
流動相：
A: 0.1 %甲酸水
B: 乙腈，含0.1 %甲酸
梯度：0分鐘，10 %B；8分鐘，38 %B；12分鐘，100 %B；持續(xù)3分鐘，然后10 %B
流速： 1.0 mL/min（ 被動分流器將進入M S 的流速降至0.4 mL/min）
柱溫：45 °C
檢測波長：203 nm
峰寬：0.5 s
狹縫寬度：4 nm
光譜：190-400 nm，2 nm步進
質(zhì)譜方法
掃描：80-1400（正/負）
碰撞誘導解離電壓：70（正/負）
干燥氣體：12 L/min
霧化器壓力：50 psi
干燥氣溫度：50 °C
毛細管電壓：3200 V（正/負）
結(jié)果與討論
用安捷倫方法轉(zhuǎn)換計算器（光盤發(fā)行號5989-5130EN）將常規(guī)液相色譜方法轉(zhuǎn)換成高分離度快速液相色譜方法。
丹參三七黃芪和降香提取物的比較
由圖1可見，在203 nm檢測波長下，丹參和三七的色譜圖與混合提取物有很大區(qū)別。混合和加熱后，某些峰消失了，同時出現(xiàn)了一些新的色譜峰。
目標化合物篩選是質(zhì)量控制的重要步驟，可以確定加工過程中這些化合物是否發(fā)生了變化。大多數(shù)研究者都用203 nm進行檢測，因為主要活性化合物是皂甙，在203 nm波長下有弱吸收。但203 nm處的大峰可能與質(zhì)量控制無關，那些小峰可能對研究活性成分更重要。因此，需要另一種靈敏度更高的檢測器，提供這些成分的更多信息。
不同檢測器和條件之間的比較
圖2 顯示了紫外和MS檢測的不同結(jié)果。在MS的總離子色譜圖中有更多的峰，因為某些成分紫外吸收很弱或者沒有吸收。用MS檢測增加了另一維數(shù)據(jù)，并得到了這些不同化合物的結(jié)構(gòu)信息。負離子模式給出了這些峰更完整的信息，可以對質(zhì)量控制的目標化合物進行鑒定。
芪參益氣滴丸和不同提取物之間的比較
圖3 顯示了丹參、黃芪和降香提取物與芪參益氣滴丸（由這三種提取物和其它填加劑制成）的色譜圖。標記數(shù)字的峰就是對這一中藥制劑質(zhì)量控制篩選到的目標化合物。根據(jù)UV和MS數(shù)據(jù)，研究不同的色譜峰，以確定這些化合物是否發(fā)生了改變。表1列出了鑒別的結(jié)果。
結(jié)論
本應用報告報導的RRLC-紫外和MS檢測方法比目前藥典控制單一組分的質(zhì)量控制方法更可靠，因為能夠根據(jù)UV和MS檢測器提供的信息跟蹤中藥中幾種成分的質(zhì)量。跟蹤這些成分非常重要，因為這些成分可能在炮制和加工過程中發(fā)生變化。質(zhì)譜測定使用的Agilent 6140四極桿質(zhì)譜儀，與Agilent 1200系列RRLC系統(tǒng)和Agilent化學工作站軟件能夠*集成。