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離子色譜法測定氯膦酸二鈉及其制劑 的含量和有關物質
閱讀：832 發布時間：2019-5-15氯膦酸二鈉(Clodronate Disodium，CD)又名氯屈膦酸二鈉，為代雙 膦酸鹽類化合物，是近20年來發展起來的抗代謝性骨病的一類新藥。多年臨 床研究表明，氯膦酸二鈉療效穩定，副作用較少，是控制骨溶解、修復溶骨 病灶、減少病理性骨折產生的經典藥物之一。《中國藥典》2010年版擬收載 該品種。
氯膦酸二鈉分子結構中含有兩個膦酸基團，極性強，易電離，不能在反 相液相色譜柱上保留；而且結構中沒有發色基團，不能用常規的紫外和熒光 檢測器測定。目前，該藥物的分析方法有容量分析法[1-4]、柱前或柱后衍生離 子色譜法[5-8]分析。國家現行質量標準中原料和制劑的含量測定采用容量分 析法，需先破壞氯膦酸二鈉結構產生氯離子，再用硝酸銀滴定，不僅專屬性 差，而且操作復雜[1-3]。有國外文獻[9]和進口藥品注冊標準[10]用抑制電導型離子 色譜方法測定氯膦酸二鈉注射液有關物質的方法。例如，進口藥品注冊標準 采用離子色譜方法測定氯膦酸二鈉注射液的有關物質[10]，但含量測定則用與 有關物質檢查*不同的色譜方法，需柱后衍生后用紫外光譜檢測，裝置復 雜，設備繁多[10,11]。有關同時測定氯膦酸二鈉含量及其有關物質的分析方法 尚未見報道。
離子色譜法是一種分析無機和有機陰、陽離子的重要技術，是普通液相和 氣相色譜分析離子型藥物的重要補充，在藥物分析領域的應用不斷增多[12-14]。 本研究用抑制電導型離子色譜法同時測定氯膦酸二鈉及其制劑的含量和有關 物質。
測試條件
儀器：賽默飛ICS系列離子色譜帶淋洗液發生罐系統。 分析柱: IonPac AS11-HC+IonPac AG11-HC，4mm 流動相組成：KOH梯度淋洗0→20分鐘，20→50 mmol/L；20→24分鐘，50 mmol/L； 24→25分鐘，50→20mmol/L；25→ 30分鐘，20mmol/L。 流速：1.2 mL/min 柱溫：30℃
檢測方式：抑制型電導檢測
進樣量：25 µL
樣品前處理
有關物質的樣品制備
精密稱取氯膦酸二鈉約15mg，置10ml量瓶中，用水 溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得原料供試品溶液；精密 量取注射液2ml，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖 勻，即得注射液供試品溶液。分別精密量取上述供試品溶 液1ml，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得 對照溶液
含量測定的樣品制備
精密稱取氯膦酸二鈉對照品約15mg，置100ml量瓶 中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。 精密稱取氯膦酸二鈉約15mg，置100ml量瓶中，用水溶 解并稀釋至刻度，搖勻，即得原料供試品溶液。精密量 取本品2ml，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻， 精密量取本品5ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖 勻，即得注射液供試品溶液。取裝量差異項下的內容物， 研細，精密稱取細粉適量(約相當于氯膦酸二鈉240mg)， 置100ml量瓶中，加水適量，超聲處理10分鐘，放冷， 加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5ml，置 100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得膠囊供試品 溶液。
結果與討論
1 有關物質
1.1 色譜系統的確定
抑制型電導檢測器對水溶液中離子狀態存在的成分是 一種具有較高靈敏度的通用型檢測器。NaOH或KOH是一 種非常理想的淋洗液，淋洗液中的Na+或K+在抑制反應中 與再生液中H+發生交換，H+與OH-結合成低電導的水，使 淋洗液背景的電導大大降低，同時增加了被測離子的靈敏 度。但這種堿性溶液非常容易吸收空氣中的CO2，CO2在 堿性溶液中轉變成淋洗液強度較OH強的CO32-，導致高的 噪音并改變色譜行為。淋洗液在線發生器可獲得純的OH溶液，與對OH-優化的親水性分離柱結合后能獲得基線變 化極小的梯度淋洗系統，有望成為測定藥品有關物質的一 種通用型分析手段。 抑制型電導檢測離子色譜方法在測定藥品雜質方面的 應用已有報道[10,14]。進口藥品注冊標準JX20060101采用 了復雜的曲線梯度洗脫方式，根據生產工藝只選擇兩種雜 質進行測定[10]。本文采用常見的線性梯度洗脫方式，主成 分與各種雜質分離良好，見圖1
氯膦酸二鈉原料的國家現行質量標準還采用與標準氯 化鈉溶液和磷酸鹽溶液比色的方法檢查氯化物和磷酸鹽， 采用間接碘量法檢查亞磷酸鹽，操作過程冗長費時，需用 多種化學試劑，消耗大量樣品，靈敏度低而且有干擾[1]。 采用新的線性梯度洗脫方法，不僅能將雜質與主成分* 分離，而且氯離子、亞磷酸根離子和磷酸根離子均與其他 雜質*分離，因此可以替代現行質量標準的方法同時 準確測定原料中的氯化物、亞磷酸和磷酸，大大提高檢 驗效率。
1.2 檢測限、溶液的穩定性和強制破壞實驗 按信噪比為3計算，氯膦酸二鈉的檢測限約為0.3 ng。
取注射液供試品溶液1份，分別在0小時、17小時、 19小時、20小時和23小時后進樣，大雜質含量和總雜 質含量均無明顯變化，主成分峰面積的RSD為0.6%。 取注射液樣品5份，分別用0.1mol/L鹽酸2ml、 0.1mol/L氫氧化鈉溶液2ml、3%過氧化氫溶液2ml、 100℃加熱1小時和3000Lx強光照射1天處理，考察降解 產物與主成分的分離情況。結果顯示，溶液狀態下的氯膦 酸二鈉對熱和氧化不穩定(圖2)，加熱和氧化后相對保留 時間約0.37和0.17的雜質含量分別明顯增加；對光、酸和 堿穩定。固體狀態下氯膦酸二鈉性質穩定，在105℃加熱 18小時失去四個結晶水后雜質含量也幾乎未增加。采用 上述色譜條件，破壞性試驗產生的各種雜質對主成分峰的 測定無干擾。
1.3 樣品的有關物質
分別取對照溶液和取供試品溶液注入色譜儀，記錄色 譜圖，按主成分自身對照法計算大雜質含量和雜質總含 量，結果見表1。氯膦酸二鈉在溶液中受熱不穩定，而其 注射液一般采用高溫濕熱滅菌的生產工藝，因此雜質含量 比原料明顯增多，需要進行控制。C廠批號為74090的注 射液雜質含量少。由于在上述色譜條件下，主成分色譜 峰與各雜質色譜峰、各主要雜質色譜峰之間均基本*分 離，如有雜質對照品，可用更準確的對照品法或帶校正因 子的主成分自身對照法測定雜質。
2 含量測定
2.1 色譜條件的選擇
在有關物質檢查的色譜條件基礎上，將梯度洗脫改為 45mmol KOH溶液的等度洗脫測定含量，其他條件相同。 按照注射液和膠囊處方稱取適量的空白輔料配制成供試品 溶液，結果顯示輔料不干擾主成分的含量測定。用水溶液 中常見的氟、碳酸根、硫酸根、溴、硝酸根和原料中需要 控制的氯、亞磷酸根和磷酸根八種離子與氯膦酸二鈉對照 品溶液混合后進樣分析，在上述色譜條件下氯膦酸二鈉與 八種陰離子能*分離（圖3），主成分色譜峰出峰時間 約為7.2分鐘。
采用抑制型電導檢測器的離子色譜系統比傳統的液相 色譜系統需要更長的平衡時間。在本文的色譜條件下，一 般需要至少預先平衡約1天時間，如抑制器為新抑制器或 長時間未使用，則需要更長的平衡時間。適當增大抑制器 電流可加快系統的平衡。例如，連續平衡1天后注射液含 量測定的6次進樣重復性和6小時溶液穩定性分別為0.6% 和0.8%，連續平衡2天后膠囊含量測定的6次進樣重復性 和6小時溶液穩定性分別為0.2%和0.3%，均優于文獻報 道的柱后衍生離子色譜法[11]。采用供試品溶液與對照品 溶液平行進樣的方式也能減少抑制型電導離子色譜方法 的誤差。
2.2 回收率
按注射液和膠囊處方，分別精密稱取氯膦酸二鈉和輔 料適量，配成相當于測試濃度80%、100%和120%的三 種濃度的溶液，每個濃度各三份供試品溶液，按上述方法 測定含量，注射液和膠囊的平均回收率為分別為100.1% 和98.9%，RSD分別為0.7%和0.6% (n=9)。
2.3 線性范圍、重復性和溶液的穩定性 精密稱取四水氯膦酸二鈉對照品23.85mg，置 100ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取3ml、5 ml、7 ml、8ml分別置 10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖 勻，分別進樣測定。以峰面積A對濃度c進行線性回歸， 得回歸方程為A = 50.151c－0.255 (r=0.9999，n=5)。表 明氯膦酸二鈉濃度在0.0568～0.1895mg/ml范圍內，峰面 積與測定濃度呈良好的線性關系。
取注射液和膠囊供試品溶液各一份連續進樣6次，主 成分峰面積的RSD%分別為0.6%和0.2%。 取注射液和膠囊供試品溶液各1份，分別連續6小時 進樣，主成分峰面積的RSD分別為0.8%和0.3%。
2.4 樣品含量測定
分別取對照品溶液和供試品溶液進樣測定，按外標法 以峰面積計算含量，測定結果與原方法的比較見表1。其 中，原料為按國家現行標準的容量分析法檢驗，按干燥品 計算的含量結果；制劑為廠家按照國家現行標準的自檢結 果。可以看出，離子色譜方法與原方法的測定結果基本一 致。該方法無需對樣品進行特殊處理，操作更簡單，檢驗 更快捷，專屬性更強。
結論
賽默飛ICS系列離子色譜在檢測離子型或可離子化藥物方面具有很 大的優勢。氯膦酸二鈉在水溶液中呈弱酸性，在堿性介質 中可轉變成為陰離子，因此可以用離子色譜法測定其含 量及有關物質。本研究應用抑制電導型離子色譜法同時測 定氯膦酸二鈉及其制劑的有關物質和含量，方法準確、靈 敏、專屬、快速，避免了復雜的樣品預處理和衍生化過 程，同時測定多種組分，能更好地控制氯膦酸二鈉及其制 劑的產品質量。