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在園藝和植物科學領域，延長花卉的花期一直是研究的熱點和挑戰(zhàn)。近期，一項關于日本牽牛花花期延長的研究引起了廣泛關注。研究團隊使用AlphaScreen技術建立了一個高通量篩選系統(tǒng)，對一個包含9,600種化合物的文庫進行了篩選，以尋找能夠抑制EPH1-DNA相互作用的化合物，通過篩選成功地發(fā)現(xiàn)了兩種抑制花瓣衰老的關鍵調(diào)節(jié)因子EPH1的DNA結(jié)合活性的化合物，從而顯著延長了花卉的花期。
EPH1是一個NAM/ATAF1,2/CUC2（NAC）轉(zhuǎn)錄因子，是花瓣衰老過程中的關鍵調(diào)控因子，對花瓣衰老過程中的程序性細胞死亡（PCD）起著關鍵作用。
研究人員首先合成了帶有C末端AGIA標簽的EPH1蛋白，并確定了EPH1與其靶標DNA（VPE序列）的結(jié)合。通過AlphaScreen技術，他們檢測到了EPH1與VPE DNA之間的強烈信號，而與突變的VPE DNA（mVPE）的結(jié)合則產(chǎn)生了很低的信號，表明該系統(tǒng)能夠有效地檢測EPH1與特定DNA序列的相互作用。
圖1：EPH1與DNA相互作用的高通量分析系統(tǒng)的建立以及EPH1抑制劑的篩選流程。使用AlphaScreen技術，用于檢測使用AGIA標記的EPH1蛋白與生物素標記的其靶標DNA之間的作用。
接著，研究人員利用這一系統(tǒng)對一個包含9,600種化合物的文庫進行了篩選，以尋找能夠抑制EPH1-DNA相互作用的化合物。他們發(fā)現(xiàn)了Everlastin1和Everlastin2，這些化合物能夠抑制EPH1與DNA的結(jié)合，并顯著延遲花瓣的衰老。通過進一步的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)這些化合物通過抑制EPH1的二聚化來發(fā)揮作用，從而阻止了EPH1與DNA的結(jié)合。
圖2：第一輪篩選中得到的化合物結(jié)果：G1、G2和G3類似物的抑制EPH1-DNA相互作用活性的測試結(jié)果，化合物對花瓣衰老的影響，以及它們對花瓣蛋白含量的影響。
圖3：AlphaScreen技術檢測Everlastin1和Everlastin2對EPH1與DNA相互作用及對EPH1蛋白二聚化的影響的影響：EPH1全長蛋白（EPH1-FL）與VPE DNA的相互作用的影響，EPH1 DNA結(jié)合域（EPH1-DBD）與VPE DNA的相互作用的影響。
通過RNA測序分析顯示，這些化合物的處理強烈抑制了與程序性細胞死亡和自噬相關的基因表達。這些結(jié)果表明，針對轉(zhuǎn)錄因子的化學方法可以調(diào)節(jié)花瓣衰老，為延長觀賞植物的花期提供了新的化學策略。
圖4：Everlastin1和Everlastin2處理的花瓣的染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和轉(zhuǎn)錄組分析：使用抗EPH1抗體進行的ChIP-qPCR分析，以及Everlastin1處理對基因表達的影響。
研究人員通過體外實驗和生物測定，進一步證實Everlastin1和Everlastin2處理能夠延遲花瓣衰老的進程，驗證了這些化合物在延遲花瓣衰老方面的效果，這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解植物花瓣衰老的分子機制提供了新的見解，而且為開發(fā)延長觀賞植物花期的化學制劑提供了可能。
圖5：Everlastin1和Everlastin2對花瓣衰老的影響。圖中展示了這些化合物對花瓣可見衰老的時間進程、蛋白含量、DNA降解以及花瓣面積的影響。
進一步分析與應用：研究還探討了這些化合物可能對其他轉(zhuǎn)錄因子（如NAC TFs）的影響，并提出了進一步研究這些基因以增強對花瓣衰老分子機制的理解。此外，研究團隊還考慮了這些化合物可能對其他轉(zhuǎn)錄因子和/或過程的影響及其在農(nóng)業(yè)和園藝領域?qū)嶋H應用中的潛力，如通過噴灑或浸泡處理來延長盆栽或切花的花期。
在這項研究中，瑞孚迪（Revvity）公司的先進技術和儀器發(fā)揮了至關重要的作用。
瑞孚迪的高通量篩選系統(tǒng)
利用Envision多功能酶標儀搭配AlphaScreen技術檢測。
Flexdrop納升級分液器用于384孔AlphaPlate液體分配。
研究團隊利用瑞孚迪的高通量篩選系統(tǒng)，對9,600種合成的化合物進行了篩選，尋找到了目標化合物。瑞孚迪高通量篩選系統(tǒng)的高效性和精確性為研究提供了強有力的支持，確保了篩選過程的準確性和可靠性。通過這一系統(tǒng)，研究團隊成功地識別出了能夠顯著延遲花瓣衰老的化合物，為后續(xù)的實驗奠定了基礎。
關于Envision多功能酶標儀
更快的速度、通量和靈敏度
EnVision多模式微孔板檢測儀具有更快的速度、更高通量和所有檢測技術中的上佳靈敏度。作為高通量篩選的金標準，EnVision微孔板檢測儀以更高靈敏度和通量，始終如一地為您提供強大的檢測性能和穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)。
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標準EnVision系統(tǒng)可檢測所有傳統(tǒng)檢測技術：
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化學發(fā)光，包括輝光型化學發(fā)光、閃光性化學發(fā)光和雙報告基因化學發(fā)光
時間分辨熒光(TRF)和TR-FRET，包括我們的DELFIA、LANCE和LANCE Ultra技術，以及HTRF®和LanthaScreen™
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提高性能、容量和通量
我們的 AlphaScreen®和AlphaLISA®激光檢測
技術，包括 AlphaPlex™
超靈敏化學發(fā)光
TRF激光檢測模塊
四光柵模塊
關于AlphaScreen技術
在確認化合物活性時，AlphaScreen技術在這項研究中發(fā)揮了關鍵作用。這一技術能夠精確檢測化合物對EPH1與DNA相互作用的影響，確保篩選結(jié)果的準確性。AlphaScreen技術是一種基于微珠的非放射性檢測方法，它具有多種優(yōu)勢，在蛋白質(zhì)相互作用檢測領域中比其他技術更為有效和方便：
高靈敏度：AlphaScreen技術利用供體和受體珠子之間的近距離相互作用產(chǎn)生信號，這種相互作用可以在非常低的濃度下檢測到，因此具有很高的靈敏度。
高通量：可以在微孔板格式中進行，因此適合自動化和高通量篩選，這對于藥物發(fā)現(xiàn)和化合物庫篩選尤為便利高效。
寬動態(tài)范圍：檢測從皮摩爾到微摩爾范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度，這使得它能夠適應不同的實驗條件和樣品濃度。
高數(shù)據(jù)質(zhì)量：利用時間分辨檢測來區(qū)分特異性信號和背景信號，這有助于提高數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。
適用性廣泛：可檢測多種類型的分子相互作用，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-小分子等，樣本包括細胞裂解物、血清、血漿、體液等生物學粗提取，而不會影響測讀效果，這使得它在生物化學和分子生物學研究及藥物研發(fā)領域中具有廣泛的應用。
高度靈活性：可以與各種生物分子標簽兼容，如生物素、鏈霉親和素、抗體等，這增加了實驗設計的靈活性。
關于FlexDrop納升級分液系統(tǒng)
在文中提到的高通量篩選中，使用了瑞孚迪公司的FlexDrop儀器來分配試劑，將蛋白、抗體及微珠等精確地分配到384孔AlphaPlate中，以進行高通量篩選。
FlexDrop的使用大大提高了篩選過程的自動化程度，確保了試劑分配的精確性和重復性，這對于高通量篩選實驗的成功至關重要。研究人員能夠高效地測試大量候選化合物，以尋找潛在的EPH1-DNA相互作用抑制劑。
FlexDrop特點及應用：
96源孔+獨立控制的8正壓通道
精準分液，每個脈沖產(chǎn)生一個8-50 nL微滴
內(nèi)置微滴檢測系統(tǒng)，每個微滴計數(shù)和監(jiān)測
死體積<1 uL，減少試劑浪費
FlexDrop在多領域的廣泛應用：
基因組學及蛋白組學，藥物篩選，試劑開發(fā)，NGS文庫制備，PCR體系構(gòu)建，化合物分配，細胞分液，高通量篩選，免疫分析，昂貴試劑的加液…
