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ALPHA（Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay）是一種基于微珠的高靈敏度均相檢測技術。與 HTRF 技術類似，ALPHA 技術適用于藥物發現階段的高通量篩選，屬于免洗的免疫檢測技術，已在國內外藥物研發企業和科研院所中獲得廣泛認可。本文將簡要介紹 ALPHA 技術的原理、技術特點、家族及主要應用、多重檢測以及使用注意事項。
一、Alpha 基本原理
Alpha 技術使用供體和受體兩種微珠。當結合于供體微珠上的分子 A 與結合于受體微珠上的分子 B 相互作用，且兩個微珠距離足夠接近（<200nm）時，能夠檢測出發光信號。供體微珠表面的光敏劑經 680nm 的激光照射后被激發，將周圍的氧轉變為單線態氧。單線態氧在溶液中擴散，遇到受體微珠后可在受體微珠內引發一系列級聯放大的化學反應，并最終發射出光。若分子 A 與分子 B 不發生相互作用，則供體微珠產生的單線態氧不會到達受體微珠，從而不會引發化學發光反應。
二、Alpha 技術特點
均相檢測：無需洗滌步驟，操作簡便。
較寬檢測范圍：適合 nM 至 μM 范圍的親和力檢測。
低背景、高靈敏度：可避免環境因素的自發熒光背景干擾。
更適合生物分子檢測：有效距離可達 200nm。
更多檢測因子：適合更多的因子檢測。
可用于微量檢測：樣品用量可低至 5 微升。
易于自動化檢測：適合 96、384 和 1536 微孔板規格。
多重檢測：可用于多重因子同時檢測。
與 ELISA 相比，AlphaLISA 在洗板、實驗步驟、微孔板規格、自動化程度、實驗通量、樣品量、靈敏度、檢測范圍和性價比等方面具有明顯優勢，并且可以進行多重檢測。
三、Alpha 家族及主要應用
Alpha 微珠類型
Alpha 微珠分為供體微珠（Donor Bead）和受體微珠（Acceptor Bead）。在 Alpha 技術中，供體微珠相同，經激光激發后可產生單線態氧分子。受體微珠根據發射波長不同分為四種類型：AlphaScreen（紅熒烯，發射波長 520 - 620nm）、AlphaLISA（銪 Eu，發射波長 615 - 623nm）、AlphaPlex 545（鋱 Tb，發射波長 515 - 555nm）和 AlphaPlex 645（釤 Sm，發射波長 645nm）。
AlphaScreen 和 AlphaLISA
AlphaScreen 是第一代 Alpha 技術，受體微珠發射波長為連續的 520 - 620nm 波段。
AlphaLISA 是升級后的技術，受體微珠發射波長非常窄，峰值在 615nm 附近，可避免很多干擾因素，降低假陽性和假陰性。目前，AlphaLISA 產品已替代 AlphaScreen 的大部分產品。AlphaLISA 技術主要應用于蛋白與蛋白相互作用（PPI）、激酶和表觀遺傳學研究的生化篩選、第二信使檢測（GPCR）以及生物標志物檢測（Cytokine、Biomarker）等領域。在細胞因子檢測中，AlphaLISA 提供 Biotin-Free 版本的檢測試劑盒，降低細胞培養環境中生物素對檢測結果的干擾。AlphaLISA 還提供雙重檢測的試劑盒。
Alpha Surefire 和 Alpha Surefire Ultra
在研究信號通路的磷酸化蛋白檢測中，需使用 Alpha Surefire 系列產品。Alpha Surefire Ultra 版本進行了兩個更新設計：采用 CaptSure 技術替代早期版本的 Protein A 鏈接結構，提升抗體捕獲的特異性；改用 AlphaLISA 受體微珠，具有更好的光譜特性。目前，AlphaLISA Surefire Ultra 技術主要用于信號分子的總蛋白和磷酸化蛋白檢測。
四、Alpha 技術的多重檢測
Alpha 技術提供三種發射波長的受體微珠，理論上可同時進行三種分子的檢測，但考慮酶標儀配置因素，目前大多數情況下只能同時進行兩種分子的檢測。
AlphaLISA 的雙重檢測
Alpha 技術一般采用包被 Eu 的受體微珠，對于部分生物標志物的檢測，也提供 Tb 包被的受體微珠檢測試劑盒（AlphaPlex），可在一個微孔板孔內檢測兩種細胞因子。
Alpha Surefire Ultra 的雙重檢測
針對檢測蛋白的種類不同，分為兩種情況：
同一個靶點的總蛋白和磷酸化蛋白檢測推薦使用 MPSU 版本（Alpha SureFire Ultra Multiplex），提供套裝試劑盒，可同時檢測總蛋白及特定磷酸化蛋白的含量變化。
不同靶點的磷酸化蛋白檢測需分別購買兩種 Surefire Ultra 試劑盒，即 Alpha Surefire Ultra kit（ALSU）和 Terbium SureFire Ultra kit（TBSU），可在一個孔內同時檢測不同蛋白的磷酸化水平。目前，Alpha 提供 30 余種 TBSU 的檢測試劑盒，可與 ALSU 搭配使用。特別提示，TBSU 試劑盒不能單獨使用。
五、Alpha 技術使用注意事項
實驗過程中部分步驟需避光，盡量保持恒溫。
使用時，盡量按照說明書的操作步驟進行實驗。
微珠試劑不要冷凍保存。
實驗前請先確認酶標儀的功能和配置。
