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在癌癥免疫治療時代，諸如PD-1單抗等的熱門單靶點藥物競爭已呈現狀態，產品同質化嚴重，市場空間被嚴重擠壓，且存在耐藥性風險，以上問題刺激了對具有增強特異性和效力的雙特異性抗體的研究。雙特異性抗體（bsAb）是免疫療法中快速發展的領域，作為下一代癌癥治療策略備受關注。BsAb是重組分子，旨在同時靶向兩種不同的抗原或表位。這些抗體具有雙重鏈和輕鏈組成的傳統 Y 形結構，每個臂都有一個活性位點，可與不同的靶標結合。根據生物學靶點和作用方式，bsAb分為四大類（如Figure 1）：
| 1 | Immune effector cell redirectors , 通過與腫瘤相關抗原和免疫細胞受體（例如CD3、CD16或NKG2D）結合橋聯腫瘤細胞和免疫效應細胞； |
| 2 | Tumor-targeted immunomodulators，同時與T細胞和腫瘤細胞上的共信號分子（如CD28和4-1BB）結合，誘導激活T細胞的腫瘤特異性； |
| 3 | Dual immunomodulators, 通過協同信號傳導途徑的雙重靶向來調節兩種不同免疫調節途徑的活性； |
| 4 | 通過抑制血管生成、RTK活性或CD47結合來調節腫瘤微環境中的功能途徑。 |
Figure 1. The types of bispecific therapeutics in immuno-oncology.
BsAb作用機制在各種癌癥的臨床前和臨床研究中取得了良好的療效，目前，已有八款癌癥免疫治療bsAbs獲得FDA/EMA 的批準（如Table 1）。
Table 1: Approved therapeutic bsAbs for cancer indications.
相比于傳統單抗，bsAb在治療方面更具潛在優勢，包括：（1）介導免疫細胞對腫瘤的殺傷；（2）增強對免疫系統的激活作用；（3）雙靶點信號阻斷，防止耐藥；（4）具備更強特異性、靶向性和低脫靶毒性；（5）介導更強的內吞作用。
BsAb 的功效、安全性和臨床成功受其特性的影響，包括理化特性（大小、穩定性、結合親和力和效價）、藥代動力學 (PK)/藥效學 (PD) 特性、可制造性和免疫原性等，bsAb的全面表征對于其設計和開發以及評估其功效和安全性至關重要，故需要從多方面并結合一系列技術來全面了解bsAb的特性以及驅動免疫系統靶向癌細胞的能力。在這里，我們介紹幾種均相檢測技術來表征靶向免疫檢查點和腫瘤壞死因子 (TNF) 超家族的新型bsAb。
BsAb表征過程中的細胞因子研究的重要性
……
（1）Evaluation of an anti-PD-1–GITR-L bispecific antibody
Chan等人研究了由抗PD-1抗體與抗GITR-L抗體融合組成的bsAb對免疫細胞活性的影響。作為研究的一部分，研究者進行了PBMC共刺激檢測，以探究bsAb治療對細胞因子釋放的影響——將PBMC鋪板并在抗CD3存在的情況下用不同稀釋度的抗體進行處理。孵育48h和96h后，使用AlphaLISA®試劑盒檢測收集的上清液中的IFN-γ和IL-2水平，并使用具有Alpha模塊的酶標儀對結果進行定量。
結果顯示，與單一治療和1:1聯合治療相比，bsAb（抗 PD-1–GITR-L）治療可誘導細胞因子的劑量依賴性增加（如Figure 2）。該數據不僅提供了關于bsAb如何影響免疫細胞行為的見解，還強調了與單一療法和聯合療法的效果相比，抗PD-1-GITR-L雙特異性抗體如何具有不同的作用機制。
Figure 2: Human PBMC co-stimulation assay following the indicated treatments in the presence of anti-CD3. Cells and supernatants were harvested/collected for assessment of (A) IL-2, (B) IFN-γ, and (C) IFN-γ secretion in autologous CD4+ T cell MLR.
Figure 3: Principle of the AlphaLISA technology
AlphaLISA是一種基于微珠的均相檢測技術，AlphaLISA細胞因子測定使用兩種針對目標細胞因子的特異性抗體。一種是生物素化的，與鏈霉親和素包被的供體微珠結合，另一種則直接與受體微珠結合。在細胞因子存在的情況下，抗體與細胞因子結合，使供體和受體微珠靠近，當供體微珠激發后產生單線態氧進而激發受體微珠產生特異性信號，生成的AlphaLISA信號與樣品中存在的細胞因子的量成正比關系。
（2）Evaluation of an anti-PD-L1–VEGF bispecific antibody
2021年上海復旦大學張雪梅團隊開發了一種新型雙特異性抗體HB0025，該抗體同時靶向PD-L1和VEGF。該bsAb是通過將VEGF受體1結構域(VEGFR1D2)與抗PD-L1 mAb融合而形成的。作為研究的一部分，研究人員通過測量細胞因子分泌水平來評估HB0025阻斷PD-1和PD-L1之間相互作用的能力。將PBMC與樹突狀細胞在96孔板中共培養，并接受HB0025、atezolizumab（一種PD-L1靶向抗體）、bevacizumab（一種VEGF靶向抗體）、陰性對照 (900543) 的處理。經過5天的孵育期后，使用HTRF技術檢測上清液中IL-2的濃度。
結果顯示，HB0025和atezolizumab均以劑量依賴性方式促進IL-2分泌增加，VEGF靶向抗體bevacizumab不會影響IL-2的分泌（如Figure 4）。該數據證明了HB0025的抗腫瘤作用，并表明新型雙特異性抗體有效維持了其parent molecular的結合和阻斷能力。
Figure 4: The dose-effect fitting curve of antibodies on the recovery of human IL-2 secretion, taking 900543 as the negative control.
Figure 5: Principle of the HTRF assay
HTRF是一種基于熒光基團的均相檢測技術，該技術將熒光共振能量轉移 (FRET) 技術與熒光時間分辨測量相結合（如Figure 5）。針對細胞因子檢測，其中一個抗體標記了供體熒光基團，另一個抗體標記了受體熒光基團，當加入待分析物時，如果待分析物同時與兩個抗體都結合，則供體熒光基團和受體熒光基團的距離被拉進，當激發供體熒光基團后，供體和受體之間產生FRET，進而激發受體熒光基團產生特異性信號，該信號與待分析物的濃度成正比關系。
BsAb表征過程中的殺傷作用的重要性
……
Rajendran等人研究靶向CD30和CD137的bsAb是否可以增強基于抗體治療霍奇金淋巴瘤（HRS）的特異性。該BsAb設計用于選擇性結合CD30/CD137雙陽性HRS細胞。為了測試bsAb的殺傷效率，研究者使用DELFIA® EuTDA試劑盒進行了ADCC測定。該項研究中，HRS細胞用DELFIA BATDA試劑標記，并與雙特異性抗體和對照抗體一起接種到96孔板中，然后添加效應細胞（NK細胞）并孵育3h。該測定的讀數基于使用多功能酶標儀測量的熒光值，測量的信號值與裂解細胞的數量直接相關。
結果表明，與對照抗體相比，使用兩個bsAb clone進行處理可使雙陽性 (CD30+ CD137+) 細胞的殺傷率增加約4倍（如Figure 6）。此外，與自發裂解水平相比，這些clone對單陽性細胞的殺傷效率相當。這表明bsAb對雙陽性細胞的選擇特異性，突出了bsAb觸發針對特定細胞群的ADCC潛力。
Figure 6: ADCC activity of bispecific antibodies.
HL cells were labeled with 1 μl/ml of BATDA reagent and treated with 5μg/ml of bispecific antibodies (137A-30A, 137A-30B) or human IgG(Isotype) for 40min at 4°C. Effector NK cells were added at E:T of 20:1 and incubated for more than 3 hours. Means ± SD of fold killing are represented (**p<0.01). Data are representative of three independent experiments.
Figure 7: DELFIA EuTDA Cytotoxicity Assay for ADCC Determination.
DELFIA Eu TDA檢測法是一種非放射性的細胞殺傷檢測方法，具有標記特異性，高靈敏度，可操作性，安全性，穩定性等優點。如Figure 7，靶細胞與BATDA進行孵育標記，然后與抗體結合，并與免疫效應細胞共培養。抗體與靶細胞表面的抗原結合，而效應細胞與抗體的Fc區結合，與靶細胞形成復合物。復合物的形成會激活免疫效應細胞，從而對靶細胞進行細胞裂解，細胞裂解后TDA被釋放到上清液中。將上清液轉移至新的檢測板中，并添加Eu3+ solution以形成EuTDA螯合物，使用兼容時間分辨熒光（TRF）的酶標儀進行讀值（設置檢測信號在340nm處激發，在615nm處發射）。
小結
雙特異性抗體的成功在于其能夠克服當前免疫療法的局限性，并提高療效和安全性。盡管目前獲批的bsAb產品不多，但隨著血友病領域雙特異性抗體 Emicizumab的成功上市，并在5年間成為年銷售額33億美元的全球重磅藥物，引發了一波雙特異性抗體研發熱潮。
瑞孚迪（Revvity）擁有一系列的高通量檢測技術平臺（HTRF，ALPHA，LANCE，DELFIA），同時還提供Toolbox 試劑以及實驗服務，可以滿足您對雙特異性抗體研究的多種需求，助力您獲得結果。
