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今年2月16日，Iovance Biotherapeutics公司宣布FDA加速批準(zhǔn)其腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）療法AMTAGVI（lifileucel）上市，用于治療先前經(jīng)過PD-1抗體治療的不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤成年患者。據(jù)悉，lifileucel是款獲批上市的TIL細(xì)胞療法，標(biāo)志著細(xì)胞療法在腫瘤治療領(lǐng)域的又一重要里程碑。

開發(fā)有效的TIL療法需要對TIL細(xì)胞本身的功能特性的深入理解，更取決于如何開發(fā)能夠快速擴(kuò)增且保持TIL細(xì)胞功能的生產(chǎn)工藝。在TIL回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，治療作用的持久性如何保持，也需要對T細(xì)胞的動力學(xué)有更深入的了解。IsoSpark/IsoLight單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)表征平臺自上市以來，在細(xì)胞治療領(lǐng)域被應(yīng)用于不同的研發(fā)階段。在TIL療法領(lǐng)域，關(guān)于TIL的功能研究、生產(chǎn)工藝評估和回輸后的免疫監(jiān)控上都已經(jīng)有應(yīng)用案例。其中近期備受關(guān)注的Iovance在其生產(chǎn)工藝的優(yōu)化中也使用到IsoCode單細(xì)胞適應(yīng)性免疫芯片，用于評估TIL細(xì)胞的多功能性。我們今天再重溫一下幾個(gè)經(jīng)典案例。

案例1：TIL生產(chǎn)工藝開發(fā)過程中T細(xì)胞功能評估

研究目的

Iovance開發(fā)第二代生產(chǎn)工藝（Generation-2）擴(kuò)增的TIL，是否讓TIL細(xì)胞群體重新激活，相對于內(nèi)源性TIL（D0），經(jīng)過22天的培養(yǎng)擴(kuò)增后得到的細(xì)胞產(chǎn)品功能評估。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

從消化的腫瘤活檢中分離的內(nèi)源性CD3+ TIL（D0）進(jìn)行分選，并與使用 Iovance的Gen 2工藝擴(kuò)增22天后（D22）的TIL進(jìn)行比較（圖1）。來自黑色素瘤、宮頸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的7對D0和D22 TIL的T細(xì)胞亞群，利用TCR復(fù)合物激活后上樣到IsoCode單細(xì)胞適應(yīng)性免疫芯片上，評估比較D0和D22兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)CD4+和CD8+ T細(xì)胞的多功能性。

圖1. 實(shí)驗(yàn)流程圖和IsoCode單細(xì)胞分泌蛋白組芯片靶標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)TIL細(xì)胞剛剛從腫瘤組織中分離出來時(shí)，幾乎沒有多功能細(xì)胞。經(jīng)過Iovance第二代TIL擴(kuò)增培養(yǎng)22天后，TIL中CD8+和CD4+的多功能性細(xì)胞比例和PSI（細(xì)胞多功能強(qiáng)度指數(shù)）顯著升高，共計(jì)八種細(xì)胞因子被檢測到。說明Iovance的第二代（Gen2）TIL擴(kuò)增方案從多功能細(xì)胞角度能夠讓T細(xì)胞有效激活。

結(jié)論

IsoCode單細(xì)胞分泌蛋白組芯片提供對于TIL細(xì)胞治療產(chǎn)品工藝變更后對工藝進(jìn)行評估。

圖2. IsoCode單細(xì)胞分泌蛋白組芯片分析腫瘤中分離出的TIL（D0）和擴(kuò)增后TIL（D22）功能。

案例2: 多組學(xué)表征腫瘤中CD8+T細(xì)胞

研究目的

對多個(gè)患者隊(duì)列和六大類腫瘤類型的CD8+ T細(xì)胞特征進(jìn)行多組學(xué)分析。通過生成的scRNA-seq 和 scTCR-seq 數(shù)據(jù)以及使用薈萃數(shù)據(jù)集進(jìn)行概念驗(yàn)證分析。這些概念在功能上用原始患者樣本進(jìn)行了功能等多方面的驗(yàn)證。這使研究者能夠精確地定義富集CD8 + TEX的人類腫瘤與其他類型的功能低下CD8 + T細(xì)胞的不同特征。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

單細(xì)胞功能蛋白組學(xué)平臺用于評估膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）腫瘤組織內(nèi)CD8+ T細(xì)胞的功能。從GBM切除的腫瘤樣本中新鮮分離出患者來源的CD8+ T細(xì)胞與健康人PBMC來源CD8+T細(xì)胞比較，評估其在anti-CD3/CD28刺激下或無刺激下的功能變化（圖3A）。

圖3. 功能性單細(xì)胞分泌組分析揭示GBM來源的CD8+ T細(xì)胞的耐受樣表型。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

聚類結(jié)果顯示，盡管刺激條件相同，PBMC和GBM來源的腫瘤CD8+T細(xì)胞顯示出不同聚類（圖3B）。與PBMC相比，激活后的GBM CD8+T細(xì)胞的多功能性非常低，變化幅度也明顯更低（圖3C, D）。GBM來源T細(xì)胞的PSI不是由效應(yīng)細(xì)胞因子 (IFN-γ) 或炎癥細(xì)胞因子 (TNF) 的分泌驅(qū)動，而是由促骨髓趨化因子如IL-8、CCL3和CCL4（它們在傷口愈合過程中具有冗余功能）驅(qū)動（圖3E）。這些數(shù)據(jù)表明大多數(shù)GBM-CD8+ T細(xì)胞功能低下的表型可能會增強(qiáng)促骨髓細(xì)胞的功能。

結(jié)論

單細(xì)胞分泌蛋白組能夠幫助研究者探索不同腫瘤內(nèi)T細(xì)胞的功能狀態(tài)，從而更好地理解腫瘤免疫功能，并為后續(xù)的免疫治療方式提供深入見解。

其他相關(guān)閱讀：布魯克單細(xì)胞功能表征雙平臺：揭示頭頸鱗癌中腫瘤特異性T細(xì)胞功能特征

案例 3: TIL治療PD-1耐藥轉(zhuǎn)移性肺癌患者一期臨床研究

研究目的

此研究位針對PD-1后期耐藥患者加入TIL聯(lián)合療法治療的Phase I臨床試驗(yàn)。所有患者均接受至少四個(gè)周期的 PD-1免疫檢測點(diǎn)治療，對PD-1產(chǎn)生耐藥并發(fā)生腫瘤進(jìn)展的患者實(shí)施TIL治療。主要終點(diǎn)是安全性，次要終點(diǎn)包括客觀緩解率、緩解持續(xù)時(shí)間和T細(xì)胞持久性，并進(jìn)行探索性地T細(xì)胞分析。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在針對T細(xì)胞的持久性和表型的研究中，研究者采集12位患者TIL輸注前、輸注當(dāng)天和輸注后第4周和第12周PBMC，分選出CD4+和CD8+ T細(xì)胞，利用anti-CD3/CD28抗體刺激后進(jìn)行單細(xì)胞功能性評估。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖4數(shù)據(jù)比較顯示了12名患者輸注TIL前后，CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞的PSI (Polyfunctional Strength Index，多功能強(qiáng)度指數(shù))，反映了細(xì)胞同時(shí)表達(dá)多種細(xì)胞因子及其表達(dá)量，再綜合分析因子數(shù)及表達(dá)量來評估細(xì)胞的多功能活性?？梢悦黠@看到CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T的多功能細(xì)胞數(shù)量和PSI細(xì)胞多功能指數(shù)在TIL輸注后顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)TIL療法提高T細(xì)胞的功能性，對轉(zhuǎn)移性NSCLC的有效性。

圖4. TIL回輸前后外周T細(xì)胞功能變化

"We assessed the polyfunctional strength index (PSI), which is an indicator of the number of cells capable of secreting multiple types of cytokines. Since PSI reflects the ability of a T cell to carry out multiple functions, it is recognized as a metric for the potency of cell therapy, and for the efficacy of vaccines. "

綜上，IsoSpark單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)平臺能夠幫助研發(fā)者：

• ?深入理解不同腫瘤TIL的功能特征

• ?評估TIL生產(chǎn)工藝對TIL細(xì)胞功能的影響，以促進(jìn)更好的工藝的開發(fā)
  

• ?回輸后的免疫細(xì)胞功能監(jiān)測，深入理解TIL的作用動力學(xué)和人外周T細(xì)胞功能動態(tài)變化
  

參考文獻(xiàn)：

1.Michelle R. Simpson-Abelson,et al. ESMO VIRTUAL CONGRESS 2020,1053P.

2.Naulaerts, Stefan, et al. Science Translational Medicine 15.691 (2023): eadd1016.

3.Creelan, Benjamin C., et al. Nature medicine 27.8 (2021): 1410-1418.