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信號通路研究是現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域中非常重要的基礎(chǔ)研究，主要由于它涉及到細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信息傳遞網(wǎng)絡(luò)。這些信號通路控制著細(xì)胞的生長、分化和凋亡，對于維持正常生理功能和理解疾病的發(fā)生機(jī)制非常關(guān)鍵。因此，深入了解信號通路的調(diào)控機(jī)制不僅是基礎(chǔ)生物學(xué)研究中的重要環(huán)節(jié)，同時還具有潛在的商業(yè)價值，如應(yīng)用于藥物研發(fā)和疾病治療等多個領(lǐng)域。為了更好地理解信號通路的調(diào)控機(jī)制并探索潛在的治療策略，科研人員需要準(zhǔn)確、靈敏且可視化的工具。針對這方面的研究經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，螢光素酶報告基因法因其*的性能被廣泛用于信號通路研究。
一，螢光素酶報告基因法
螢光素酶報告基因法是信號通路研究中工具。它能夠幫助研究人員追蹤信號通路上特定基因的表達(dá)變化，同時也可用于檢測細(xì)胞內(nèi)某些關(guān)鍵酶的活性，從而揭示信號通路的調(diào)控機(jī)制。這種方法具有很好的靈敏度和實時性，使其能夠捕捉到信號傳遞的微妙變化，為信號通路研究提供了強(qiáng)有力的支持。
二，逐典螢光素酶報告基因檢測試劑盒
逐典螢光素酶報告基因檢測試劑盒旨在準(zhǔn)確、靈敏、高效地測定螢火蟲螢光素酶活性，應(yīng)用高通量藥物篩選、藥物活性檢測、大規(guī)模啟動子功能測定、信號通路等研究。
目前，最常使用的螢光素酶主要包括 Firefly luciferase 和 Renilla luciferase，針對報告基因檢測不同的側(cè)重需求，逐典推出了3種檢測系統(tǒng)。
三，應(yīng)用領(lǐng)域
螢光素酶報告基因法在各個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，包括核受體研究、GPCR 研究、腫瘤免疫研究、細(xì)胞殺傷研究等。
它在這些領(lǐng)域中的應(yīng)用具有明顯的優(yōu)勢，如檢測操作方便、適合高通量篩選、信號極靈敏、實驗結(jié)果穩(wěn)定且可靠等。接下來，我們將詳細(xì)探討螢光素酶在這些領(lǐng)域中的具體應(yīng)用。
1，核受體研究
在核受體研究領(lǐng)域，螢光素酶報告基因法發(fā)揮著重要作用，為核受體相關(guān)的藥物研發(fā)提供了強(qiáng)有力的支持。下面介紹一種細(xì)胞水平的核受體結(jié)合活性常見的研究方案:首先，構(gòu)建兩個載體，一個表達(dá)核受體的配體結(jié)合域（NR-LBD）和 GAL4 的 DNA 結(jié)合域（GAL4-DBD）融合蛋白，另一個包含 GAL4 上游激活序列（Upstream activator sequence，UAS）重復(fù)序列的最小啟動子和螢光素酶報告基因的載體。接著，將這兩個載體同時共轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞中，當(dāng)核受體配體與 NR-LBD 結(jié)合后可通過 GAL4-DBD 與 GAL4-UAS 結(jié)合啟動螢光素酶報告基因的表達(dá)。通過檢測螢光素酶的活性，能夠監(jiān)測核受體結(jié)合活性，篩選合適化合物。
為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，常常引入內(nèi)參報告基因，如 Renilla luciferase，以排除化合物可能引起的細(xì)胞毒性影響。通過這一技術(shù),研究人員能夠深入了解核受體的功能和調(diào)控機(jī)制，為生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)提供了有力工具。
2.GPCR研究
對于 GPCR（G 蛋白偶聯(lián)受體）研究，螢光素酶報告基因法可用于評估 GPCR 激活的效力，檢測信號通路的變化以及篩選藥物候選物,為新藥研發(fā)提供了有力支持GPCRs 激活會通過第二信使的響應(yīng)元件調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，這些元件包括 cAMP 響應(yīng)元件（CRE）、活化T細(xì)胞因子響應(yīng)元件（NFAT-RE）、血清響應(yīng)元件（SRE）和血清反應(yīng)因子響應(yīng)元件（SRF-RE，SRE 的一種突變體），這些元件位于基因啟動子區(qū)域。可以構(gòu)建這些相應(yīng)元件和螢光素酶報告基因的載體，轉(zhuǎn)入表達(dá)相關(guān) GPCR 的細(xì)胞株中。通過檢測螢光素酶的活性，能夠評估 GPCR 激活的效力，篩選合適化合物。
3.腫瘤免疫研究
在腫瘤免疫研究，尤其是免疫檢查點(diǎn)方面，螢光素酶報告基因法發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。通過構(gòu)建相應(yīng)的細(xì)胞學(xué)模型，科研人員可以深入評價相關(guān)藥物的作用機(jī)制、效力和穩(wěn)定性。
常見的應(yīng)用模型分為兩類：一種是以非常經(jīng)典的 PD-1 / PD-L1 的細(xì)胞模型為代表的免疫檢查點(diǎn)相關(guān)靶點(diǎn)阻斷模型研究藥物對 PD-1 / PD-L1 這類免疫檢查點(diǎn)及其受體的阻斷作用/激活作用；另一種是以 ADCC 細(xì)胞模型為代表的用于評價抗體藥的Fc端功能。
免疫檢查點(diǎn)相關(guān)靶點(diǎn)阻斷/激活模型：這類模型以 PD-1 / PD-L1 為代表，旨在研究藥物對 PD-1 / PD-L1 這類抑制性免疫檢查點(diǎn)及其受體的阻斷作用或?qū)有悦庖邫z查點(diǎn)的激活作用。在這類模型中，科研人員通過引入相應(yīng)的報告基因，可以實時監(jiān)測藥物對免疫檢查點(diǎn)信號通路的影響。例如，構(gòu)建一組細(xì)胞模型，其中包含一個效應(yīng)細(xì)胞和一個靶細(xì)胞。在效應(yīng)細(xì)胞中同時轉(zhuǎn)入兩個載體，一個包含了 PD-1 的表達(dá)基因，另一個包含 NFAT-RE 和 luciferase。在靶細(xì)胞中同時轉(zhuǎn)入兩個載體，一個包含了 PD-1 的表達(dá)基因，另一個包含了 TCR activator 的表達(dá)基因。通過效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的共孵育，可以模擬 PD-1 / PD-L1 的結(jié)合情況。通過檢測螢光素酶的表達(dá)水平，評估藥物對 PD-1 / PD-L1 信號通路的調(diào)控效果，為藥物研發(fā)提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。
Fc 功能驗證模型：這類模型以 ADCC（抗體依賴性細(xì)胞毒性）為代表，用于評價抗體藥的 Fc 端功能。以 ADCC 研究模型為例，選擇穩(wěn)定表達(dá) FcγRIIIa 受體的 Jurkat 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入包含 NFAT-RE 和 luciferase 的載體。一旦藥物的 Fc 與 FcγRIIIa 受體結(jié)合，激活 NFAT 信號通路，導(dǎo)致螢光素酶的表達(dá)。通過檢測螢光素酶的表達(dá)水平，評估藥物的 Fc 端功能，為藥物研發(fā)提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。
這兩類模型為腫瘤免疫研究提供了有力的工具，通過螢光素酶報告基因法，科研人員可以更全面地了解藥物對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)效果，為腫瘤免疫治療的發(fā)展和優(yōu)化提供重要支持。
4，細(xì)胞殺傷研究
螢光素酶在細(xì)胞殺傷實驗中的應(yīng)用是一種常見而有效的方法，主要通過利用螢光素酶報告基因系統(tǒng)來評估細(xì)胞存活和毒性效應(yīng)，抗體藥物研究或者細(xì)胞治療研究中用以評估效應(yīng)細(xì)胞對于靶細(xì)胞的殺傷效果。可以構(gòu)建螢光素酶報告基因的載體，轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞中。當(dāng)細(xì)胞收到損傷或者死亡時，螢光素酶活性會下降，因此通過監(jiān)測螢光素酶活性的變化，可以快速而準(zhǔn)確地評估效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效果。因為效應(yīng)細(xì)胞中不含螢光素酶，可以排除在共孵育過程中效應(yīng)細(xì)胞的自凋亡引起的干擾。
在報告基因檢測試劑盒的眾多應(yīng)用場景中，它在各個領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用以及為研究提供的靈活性和可靠性都得到了充分展示。
