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設計qPCR引物注意事項
閱讀：375 發布時間：2024-5-20qPCR實驗中，引物設計也是非常重要的一個環節，引物的合適與否與擴增效率是否達標、擴增產物是否特異、實驗結果是否可用等息息相關。
設計qPCR引物時，通常要留意以下幾點：引物盡量要跨內含子設計、產物長度100~300 bp、Tm值盡量接近60℃且上下游引物盡量接近、引物末端最好是G或C等等。
1. 引物跨內含子設計
在設計qPCR引物時，選擇跨內含子設計的引物可以使gDNA模板不能得到擴增，產物均來源于cDNA的擴增，這樣也就去除了gDNA污染造成的影響。
2. 引物長度
引物長度一般在18~30 nt之間，擴增產物長度盡量控制在 100~300 bp之間。
引物設計太短會導致非特異擴增，太長則容易形成二級結構(如發夾結構)。擴增產物太長不適于聚合酶進行反應，會影響到PCR擴增效率。
3. GC含量和Tm值
引物GC含量控制在40%~60%之間，過高或過低都不利于引發反應。正反向引物GC含量應接近相同，以便獲得相同的 Tm值和退火溫度。
Tm值應盡量在55~65℃之間，一般為60℃左右，上下游的Tm值應盡量姐接近，最好不超過4℃。
4. 引物3′端末端避免選擇A
引物3′端錯配時，不同堿基引發合成效率存在著很大的差異，當末位堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能引發鏈合成，而當末位為T時，錯配引發效率大大降低。因此引物3’端盡量避免選擇A，最好選擇T。
若為探針引物，則探針5’端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團相連時，G也可以淬滅FAM基團所發出的熒光信號，從而導致假陰性的出現。
5. 堿基分布
引物中四種堿基的分布最好是隨機的，3′端避免超過3個連續的G或C，3個以上連續的G或C容易在GC富集序列區產生配對。
6. 引物設計區域應避開復雜二級結構。
擴增產物單鏈形成二級結構會影響PCR順利進行，可通過提前預測靶序列是否存在二級結構，盡量避開該區域設計引物。
7. 引物自身和引物之間應盡量避免堿基連續互補。
引物自身和引物之間不能有連續4個堿基的互補。引物自身不應存在互補序列，否則會自身折疊形成發夾結構，而影響引物與模板的復性結合。
上下游引物之間也不能存在互補序列，引物之間互補會產生引物二聚體而降低PCR效率甚至影響定量準確性。如果引物二聚體及發夾結構不可避免，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5 kcal/mol）。
8. 引物擴增的是目標特異產物。
qPCR檢測最終目的是了解目的基因的豐度，如果出現非特異擴增，定量會不準確。所以設計好引物后，需要對其進行BLAST檢測，在序列數據庫中比對產物的特異性。