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PCR反應擴增產物出問題分析
閱讀：240 發布時間：2024-1-29 聚合酶鏈反應(PCR)技術是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。PCR實驗過程中擴增產物常出現各種問題，以下列舉解決方案供參考：
一、擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
（1）酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。
（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
（3）MgCl2濃度過高。可適當降低其用量。
（4）模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。
（5）引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。
（6）循環次數過多；增加模板量減少循環次數至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環。
（7）退火溫度過低。
（8）電泳體系有問題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；
②凝膠沒有凝固好；
③瓊脂糖質量差。
（9）若為PCR試劑盒則可能：
①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；
②試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。
（10）降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。
二. 擴增產物出現多條帶（雜帶）
（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。
（2）循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。
（3）酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。
（4）退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。
（5）樣品處理不當。
（6）Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。
（7）若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。
（8）復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。
（9）反應緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化全并全混勻。
（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。
（11）引物量過多。減少反應體系中引物的用量。
（12）模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。
（13）外源DNA污染。確保操作的潔凈。